Ce RT-PCR en temps réel convient pour diagnostiquer rapidement la rage dans les échantillons d’anti mortem et de post mortem. Les amorces pan-lyssavirus ont été optimisées pour identifier tous les membres du genre Lyssavirus. Il s’agit d’un test rapide, sensible et à tube fermé qui détecte les virus de l’ensemble du genre Lyssavirus, y compris les espèces très divergentes à partir de spécimens cliniques.
L’OIE a récemment accepté des analyses moléculaires pour signaler l’infection à la rage. Ceci est particulièrement important pour les spécimens décomposés qui ne peuvent pas toujours être diagnostiqués par la culture du virus ou les méthodes de détection des antigènes. En raison de la sensibilité de cet essai, de bonnes pratiques de laboratoire, y compris la séparation des différentes étapes est essentielle pour minimiser le risque de contamination.
Daisy Jennings, diagnostiqueur de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par quantifier l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à micro volume. Assurez-vous que la machine est réglée sur l’ARN et utilisez un à deux microlitres d’eau de qualité moléculaire pour normaliser la machine et établir une ligne de base.
Mesurez la concentration d’ARN et ajustez-la à un microgramme par microlitre. Planifiez la disposition de votre plaque PCR à l’aide d’une feuille de calcul tenant compte des échantillons de test et de contrôle. Préparez un poste de travail PCR en désinfectant les surfaces et si vous utilisez une armoire UV, allumez la lumière UV 10 minutes avant de commencer.
Retirez les réamorts et les amorces du congélateur pour décongeler, mais gardez le mélange d’enzymes sur la glace en tout temps. Mélanger brièvement les reagents et la centrifugeuse pour recueillir le liquide. Préparez des mélanges de maîtres PCR pour Lyssavirus et Beta-Actin selon les instructions manuscrites.
Laissez les mélanges maîtres sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Mélanger et centrifuger les mélanges maîtres préparés et distribuer 19 microlitres dans les puits pertinents de la plaque compatible pcr machine ou bande de tube. Dans une pièce séparée ou une armoire UV, ajouter soigneusement un microlitre de l’ARN préparé.
Si vous utilisez une armoire UV, allumez la lumière UV 10 minutes avant de commencer. Après les échantillons de test, ajoutez le contrôle positif et le contrôle sans modèle. Lors de l’ajout de l’ARN aux mélanges maîtres, assurez-vous qu’il est ajouté au puits correct.
Utilisez un plan de plaque pour aider cette étape. Scellez la plaque en vérifiant que les couvercles sont plats à travers la plaque et tournez-la vers le bas pour recueillir tout le liquide au fond des puits. Assurez-vous que chaque puits a le même volume de liquide et qu’aucune bulle n’est visible.
Ensuite, transférez les échantillons à la machine PCR. Ouvrez le programme en choisissant SYBR Green avec dissociation. Sélectionnez les puits à analyser en choisissant inconnu comme type d’échantillon et SYBR comme colorant fluorescent.
Étiquetez les puits sur la disposition de la plaque avec l’information de l’échantillon, y compris si l’analyse est pour Lyssavirus L ou Beta-Actin. Cliquez sur la configuration du profil thermo et modifiez les conditions de cycle thermique telles que spécifiées dans le manuscrit. Cliquez sur démarrer puis choisissez un emplacement pour enregistrer le fichier et coché la case pour éteindre la lampe à la fin de la course.
Lorsque l’option de commencer avant l’échauffement de la lampe apparaît, cliquez sur exécuter maintenant, mais assurez-vous que la lampe a moins de 15 minutes pour se réchauffer. Lorsque l’exécute PCR est terminée, procédez à l’analyse des données. Tout d’abord, analyser les parcelles d’amplification Lyssavirus.
Les échantillons positifs affichent des rampes exponentielles tandis que les échantillons négatifs ont des parcelles d’amplification plates sans valeurs CT. Ensuite, analyser les résultats de la courbe de dissociation du lyssavirus des échantillons d’essai à côté des échantillons de contrôle. Un échantillon positif au lyssavirus aura une température de fusion comprise entre 77 et 80 degrés Celsius et chevauchera le contrôle positif.
Ensuite, analysez les parcelles d’amplification beta-actin et les courbes de dissociation en comparant avec les contrôles pour interpréter le résultat global. Consultez le rapport texte et utilisez les détails pour enregistrer les valeurs CT et TM obtenues pour l’ARN de contrôle dans une carte de contrôle pour confirmer que l’exécuter a été un succès et que les résultats de l’échantillon de test peuvent être rapportés. Ce protocole est utilisé pour démontrer la sensibilité du Pan-Lyssavirus RT-PCR sur une série de dilution arn d’un virus standard de contrôle.
La courbe d’amplification indique qu’aussi peu que 10 picogrammes de Lyssavirus peuvent être détectés et que les courbes de dissociation vérifient la température de fusion du produit. La température de fusion est utilisée pour confirmer que l’amplicon est spécifique au Lyssavirus. Les résultats ici démontrent une plage de température de fusion à travers le genre Lyssavirus de 77,34 à 79,67 degrés Celsius.
Les valeurs de température de fusion inférieures à 76,8 ou supérieures à 80,2 sont considérées comme non spécifiques. La sensibilité de cet essai de RT-PCR est également déterminée en détectant l’ARN de trois échantillons positifs de cerveau de Lyssavirus. Aussi peu que 0,1 picogramme par microlitre d’ARN cible peut être détecté pour deux des trois échantillons.
Notamment, des représentants de toutes les espèces reconnues de lyssavirus sont détectés à l’aide de cet essai. Si l’analyse des extraits d’ARN à partir d’échantillons cliniques tels que la salive ou le CSF, les résultats de la bêta-actine peuvent être négatifs en raison d’un manque d’acides nucléiques hôtes. L’ajout d’un contrôle exogène peut résoudre ce problème.
Le séquençage des échantillons positifs au lyssavirus est recommandé pour fournir des renseignements supplémentaires sur les origines géographiques et hôtes d’une infection à rage. Le traitement des échantillons positifs ou suspects de lyssavirus doit être selon les lignes directrices locales en matière de santé et de sécurité. L’ARN extrait n’est pas infectieux, donc peut être manipulé dans les laboratoires à faible confinement.
