Les auteurs remercient Sophia Fried pour l&#39;assistance technique. MBS remercie les organismes suivants pour leur soutien à la recherche: La Fondation Israël science des subventions no.1659/08, 971/08 1503/08 et 491/10, les ministères de la Santé et sciences de subventions aucun. 3-4114 et 3-6540, l&#39;Association israélienne du cancer à travers la succession de feu Alexander Smidoda, et la Fondation de la famille Taubenblatt pour la bourse d&#39;excellence Bio-médecine.

1. La transfection des cellules T <ol><li> Préparer la solution activée Amaxa Nucleofector en mélangeant le &quot;Supplément&quot; la solution du kit à la Solution Nucleofector. La solution activée peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à trois mois. </li><li> Cultiver des cellules T Jurkat dans le milieu de culture [10% sérum de veau foetal (FCS), une solution de pénicilline-streptomycine de 1% et 2 mM de L-glutamine dans RPMI]. Idéalement, les cellules doivent être utilisées 1-2 semaines après la décongélation. En utilisant des cultures de cellules en croissance logarithmique est cruciale pour l&#39;efficacité de transfection élevée et la survie cellulaire. Sinon, avec des modifications mineures, ce protocole peut être utilisé avec des cellules T primaires, comme décrit précédemment 8. Il convient de souligner que la durée du processus d&#39;activation des cellules T primaires est plus longue que celle des cellules T Jurkat (~ 30 min), une platine de microscope monté système d&#39;incubation doit être utilisé pour maintenir le CO 2, le taux d&#39;humidité et la température dans le processus d&#39;activation. </li><li> Collecter 5× 10 6 en phase logarithmique des cellules T par transfection dans un tube de 15 ml. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante. </li><li> Lors de la centrifugation, préparer une plaque à 6 puits. Remplir un puits pour chaque transfection avec un milieu de culture de 5 ml, et les pré-incuber à 37 ° C. </li><li> Recueillir les tubes de la centrifugeuse et jeter le surnageant. Reprendre le culot cellulaire dans 1 ml de RPMI. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante. </li><li> Lors de la centrifugation, de préparer la solution de transfection. Dans un puits d&#39;une plaque de 96 puits, mélanger activé 100 ul solution Nucleofector Amaxa préparé à l&#39;étape 1 avec 5 pg d&#39;ADN du plasmide d&#39;intérêt codant pour une protéine fluorescente marquée. De manière optimale, la concentration de l&#39;ADN doit être supérieur à 1 pg / ml dans le but d&#39;éviter la dilution de la solution de transfection. </li><li> Bien mélanger par pipetage doux. </li><li> Après centrifugation des cellules, enlever soigneusement tout le surnageant alors pas disturbing la pastille. </li><li> Pipeter deux fois la solution d&#39;ADN / de transfection. </li><li> Ajouter la solution d&#39;ADN / de transfection de la pastille. </li><li> Transférer les cellules à la Amaxa cuvette. </li><li> Insérez la cuve dans l&#39;appareil Nucleofector Amaxa. </li><li> Utilisez le réglage H-10 Amaxa transfection pour l&#39;électroporation (pour Jurkat) ou T-23 (pour les cellules T primaires). </li><li> Retirer la plaque de 6 puits de l&#39;incubateur. </li><li> Après l&#39;électroporation, transfert de soin le surnageant de la suspension cellulaire de la plaque à 6 puits à l&#39;aide d&#39;une pipette Pasteur. Un culot constitué de débris de cellules peut se former. Éviter de transférer le culot. </li><li> Incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C. </li><li> Transférer 2,5 ml de suspension de cellules à partir de chaque puits dans un nouveau puits. Ajoutez milieu de culture chaud de 2,5 ml (décrite à l&#39;étape 2) à chaque puits. </li><li> Après 72 heures, transférer les cellules dans un tube stérile et centrifuger pendant 7 min à 400 g à température ambiante. Jeter le surnageant et le remplacer wiMilieu de culture ème supplémenté avec l&#39;antibiotique de sélection de cellules de mammifère approprié pour le plasmide utilisé (appliquer une concentration appropriée pour les antibiotiques utilisés; nous avons utilisé G418 et / ou l&#39;hygromycine à des concentrations de 1,3 mg / ml et / ou de 0,2 mg / ml, respectivement). Culture de la suspension cellulaire dans un nouveau puits. Alternativement, les cellules peuvent être transfectées de façon transitoire et imagés 48 heures après transfection. Pour préparer les cellules transfectées de façon transitoire, co-transfection des cellules avec les deux plasmides simultanément à l&#39;étape 8, en continuant normalement à l&#39;étape 20, puis passez directement à l&#39;étape 23. Notez que dans ce scénario, les cellules doivent être utilisées immédiatement, et généralement leur intensité de fluorescence est hétérogène et pas nécessairement élevé. </li><li> Cultiver les cellules avec du milieu de culture supplémenté avec l&#39;antibiotique de sélection approprié. Fractionner les cellules et les compléter avec un milieu de culture antibiotiques complétée au besoin. </li><li> Après 2 semaines, vérifier transfection réussie avec l&#39;utilisation de FACS (grippele tri de cellules activé par orescence) comme suit: </li><li> Recueillir 10 6 cellules transfectées, 10 6 cellules transfectées à blanc (contrôle négatif), et 10 6 cellules qui sont connus pour exprimer de façon stable la protéine fluorescente marquée. Si les cellules sont transfectées avec plus d&#39;une protéine fluorescente (voir l&#39;étape 27), utiliser plusieurs lignées cellulaires, individuellement étiquetés comme contrôles positifs. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 7 min à 400 g à température ambiante. </li><li> Jeter le surnageant. Remettre les cellules dans 500 pi de tampon FACS (PBS w / o Ca 2 + et Mg 2 +, 5% FCS, 0,05% d&#39;azoture de sodium). </li><li> Utiliser un FACS analyse pour vérifier fluorescence cellulaire. Comparer la fluorescence des cellules transfectées à celle des témoins négatifs et positifs. </li><li> Pour transfecter des cellules avec un supplément de protéines marquées par fluorescence, répéter les étapes 3 à 26 en utilisant des cellules transfectées. </li><li> Cellules présentant des niveaux élevés de fluorescence doivent être utilisés. De manière optimale, au moins 50% deles cellules de la culture doit être fortement fluorescent. fluorescence cellulaire peut être augmentée par tri cellulaire par FACS. </li></ol> Toutes les protéines marquées supplémentaires doivent être fusionnés à des fluorophores différents et être codées par des plasmides codant pour les différents antibiotiques de sélection. moyen de sélection pour les cellules transfectées avec plus d&#39;un plasmide doit être complétée par l&#39;ensemble des antibiotiques appropriés. 2. T-cell épandage Assay Preparation <ol><li> Utilisez Lab-Tek II système lamelle allemand 4 diapositives de chambre. Veillez à ne pas rayer accidentellement la surface intérieure des chambres, par exemple, avec une pointe de pipette, lors de la préparation ou de l&#39;utilisation. </li><li> Préparer une solution de préparation toboggan de 50 ml: Prendre 4,6 ml de 12 M (37%) HCl, ajouter 38,5 ml d&#39;éthanol à 100%, et de 6,9 ​​ml d&#39;eau bidistillée. </li><li> Remplir chaque chambre de la diapositive avec 500 ul solution de préparation des lames. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Aspirer la chambres, de les sécher complètement. </li><li> Incuber les lames à découvert pendant 1 h à 45 ° C jusqu&#39;à séchage complet. </li><li> Préparez 0,01% solution de poly-L-lysine par dilution de 0,1% de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) dans de l&#39;eau bidistillée. </li><li> Appliquer 500 ul à chaque chambre. </li><li> Incuber la lame pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Aspirer les chambres, les sécher complètement. </li><li> Incuber pendant 3 heures à 45 ° C jusqu&#39;à séchage complet. </li><li> Lames revêtues peuvent être stockés au sec pendant plusieurs mois à température ambiante. </li><li> Préparer une solution d&#39;anticorps d&#39;activation. Utilisez un anticorps anti-CD3: soit HIT3a (BD Pharmingen, # 555337) ou UCHT1 (BD Pharmingen, # 555330), 10 ug / ml dans 400 pi de PBS, par chambre. Cette solution doit être préparée peu avant la préparation des lames. </li><li> Remplir chaque chambre avec 400 ul de la solution d&#39;anticorps activant. </li><li> Incuber la lame pendant 2 heures à 37 ° C ou, de préférence, une nuit à 4 ° C. </li><li> Retirez le déclenchement anticorps solution et laver immédiatement la chambre deux fois avec 300 pi de PBS. De ce point, assurez-vous que les chambres restent remplis avec le tampon. </li><li> Rangez la diapositive PBS-rempli à 4 ° C. Nous vous suggérons d&#39;utiliser les chambres de diapositives préparées dans 1 semaine. </li></ol> 3. L&#39;activation des lymphocytes T et d&#39;imagerie <ol><li> Préparer tampon imagerie [1,25 ml HEPES (1 M), 10 ml de FCS, 38,75 ml de RPMI sans rouge de phénol]. Tampon Imaging peut être conservé à 4 ° C après filtration. </li><li> Activer le Zeiss LSM 510 Meta microscope. Chauffer le cadre de montage pouvant être chauffé de microscope à 37 ° C. Sélectionnez mode &quot;Expert&quot;. </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Acquérir&quot; et ouvrez les onglets suivants: les lasers; Microscopie; configuration; numérisation; séries chronologiques. </li><li> Activer les lasers nécessaires. Pour l&#39;excitation de MCFP et mYFP, réglez le Argon / 2 laser de &quot;veille&quot; pendant 5 min, puis sur &quot;on&quot;. </li><li> Si vous avez effectué ce test d&#39;imagerie des cellules vivantes avant, en utilisant les mêmes fluorophores, ouvrez le fichier LSM apparaît, cliquez sur la &quot;réutilisation&quot; icon, et reprenez à l&#39;étape 9. Sinon, poursuivez à l&#39;étape 6. </li><li> Définir des canaux à l&#39;aide de filtres appropriés pour l&#39;excitation et l&#39;émission des protéines fluorescentes utilisées. </li><li> Dans la fenêtre «Scan de contrôle&quot;, sélectionnez l&#39;option de la pile Z. </li><li> Entrez les paramètres de numérisation suivants: Nombre de tranches: 5; Intervalle: 0,5 um; tranche actuelle: 3. </li><li> Préparer un bain numérique sec Accublock (Labnet) à 37 ° C près du microscope. </li><li> Chauffer le tampon d&#39;image à 37 ° C. </li><li> Préparer la diapositive stockées par l&#39;aspiration du PBS, le remplaçant par 600 pi de tampon d&#39;imagerie chaud. </li><li> Incuber la lame à 37 ° C. Gardez la lame dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à l&#39;étape 13, pendant au moins 15 min. </li><li> Collecter 5 × 10 5 cellules T transfectées. </li><li> Centrifuger les cellules pendant 2 min à 400 x g. </li><li> Jeter le surnageant. </li><li> Remettre les cellules dans un tampon d&#39;imagerie chaude 1 ml, et de les transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Placez le tTube intérêts sur le Accublock Bain à sec numérique. </li><li> Prenez la lame chauffée de l&#39;incubateur, et le monter sur le cadre de montage de microscope réchauffé. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône &quot;VIS&quot;. </li><li> Mélanger la suspension cellulaire et retirer 1-2 pl. </li><li> Insérer la pointe de la pipette dans la mémoire tampon d&#39;image au-dessus du fond de la glissière. Évitez de vous gratter la diapositive. </li><li> Ensemencer les cellules sur le diaphragme de l&#39;objectif. </li><li> Immédiatement commencer à suivre visuellement les cellules fluorescentes comme ils descendent. Sélectionnez une cellule qui affiche une grande fluorescence dans les deux canaux. </li><li> Avant la cellule atteint la surface de la lame, activer le mode LSM. </li><li> Basculer seul laser d&#39;excitation. Sélectionner un laser pour lequel vous avez un canal DIC. </li><li> Réglez le zoom à 1. Cliquez sur l&#39;icône &quot;Fast XY&quot;. Cliquez sur l&#39;icône &quot;Stop&quot;. Utilisation de l&#39;outil de recadrage, sélectionnez un retour sur investissement centré sur la cellule. </li><li> Réglez le zoom sur 3. Cliquez sur l&#39;icône &quot;Fast XY&quot;, puis régler manuellement la mise au point de voir de manière optimale la cellule. Cliquez sur le &quot;Stop&quot; icon. </li><li> Basculer tous les lasers d&#39;excitation nécessaires. </li><li> Commencez l&#39;enregistrement en cliquant sur l&#39;icône &quot;Startt&quot;. L&#39;image de la cellule pour l&#39;ensemble du processus d&#39;étalement (communément 5 min). Lorsque vous avez terminé, cliquez sur l&#39;icône &quot;Stop&quot;. </li><li> Enregistrez le fichier. </li><li> Pour acquérir des cellules supplémentaires, cliquez sur l&#39;icône &quot;VIS&quot;. Si il ya des cellules qui n&#39;ont pas encore entré en contact avec le fond de la diapositive, reprenez à l&#39;étape 23. Évitez l&#39;imagerie de cellules qui ont déjà commencé le processus de propagation. Sinon, passez à l&#39;étape 32. </li><li> Si la zone de diapositive observée est essentiellement dépourvue de cellules, ajouter une autre aliquote de cellules (reprenez à l&#39;étape 20). Sinon, passez à l&#39;étape 33. </li><li> Pour acquérir des cellules supplémentaires, déplacer le chariot de sorte que la zone au-dessus de l&#39;ouverture de l&#39;objectif est dépourvue de cellules. </li><li> Ajouter une autre aliquote de cellules (et continuent de l&#39;étape 20). </li><li> Après avoir effectué toutes les images souhaité, ouvrez un fichier LSM sauvé. </li><li> Cliquez sur &quot;Galerie&quot;, &quot;Time + Z&quot; et &quot;sous-ensemble&quot;. </li><li> Sélectionnez la pertinent de plage de temps et Z pile. </li><li> Enregistrez le nouveau fichier. </li><li> Effectuer les étapes 35-38 pour tous les fichiers d&#39;imagerie. </li></ol> 4. L&#39;analyse des données d&#39;imagerie <ol><li> Ouvrez les fichiers de LSM en utilisant le logiciel Imaris (Bitplane AG, Zurich Suisse). </li><li> Cliquez sur &quot;surpasser&quot;. Cliquez sur le menu «Image Processing&quot;, et sélectionnez &quot;Swap Temps et Z&quot;. Cela aidera à la culture correcte de l&#39;image. </li><li> Cliquez sur la barre d&#39;outils &quot;Edition&quot; et sélectionnez l&#39;option «3D des cultures&quot; dans le menu déroulant. Recadrer l&#39;image afin d&#39;inclure uniquement la zone entourant la cellule. Nous vous suggérons de culture une place de 300 × 300 pixels centré sur la cellule. Notez que la forme et l&#39;emplacement de la cellule peuvent changer au fil du temps. Constatant l&#39;axe t, assurez-vous que la cellule est dans la région découpée en tous points dans le temps. </li><li> Cliquez sur le menu «Image Processing&quot;, et sélectionnez &quot;Swap Temps et Z&quot; pour rétablir la séparation temporelle originale de l&#39;image. </li><li> Appuyez sur le bouton &quot;Coloc&quot; dans la barre d&#39;outils principale. Sélectionnez l&#39;option &quot;Créer Heure Dep. Coloc &quot;. Imaris calcule automatiquement les seuils d&#39;intensité pour chaque canal à chaque point de temps. </li><li> Voir les résultats de l&#39;analyse de colocalisation en sélectionnant «Statistiques Channel&quot;. Exporter les données en cliquant sur &quot;Exporter&quot;. </li><li> Répétez les étapes 1 à 6 pour chaque cellule imagé. Nous recommandons au moins 50 cellules seront analysées de cette manière. </li><li> Calculer le coefficient moyen de co-localisation de Pearson et son erreur ou déviation standard. </li></ol>

<ol>
	<li>Viret, C., Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+and+T+cell+development.">MHC and T cell development.</a> Rev. Immunogenet. 1, 91-104 (1999).</li><li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+antimicrobial+peptides:+multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity.">Leukocyte antimicrobial peptides: multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> J. Leukoc. Biol. 68, 785-792 (2000).</li><li>Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+T+cell+effector+and+memory+function+in+viral+immunity.">Cytotoxic T cell effector and memory function in viral immunity.</a> Curr. Top Microbiol. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+cytoskeleton+in+T+cell+activation.">The actin cytoskeleton in T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 233-259 (2008).</li><li>Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+leading+from+the+T-cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton+network.">Multiple pathways leading from the T-cell antigen receptor to the actin cytoskeleton network.</a> FEBS Lett. 584, 4858-4864 (2010).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+molecular+interactions+linking+the+T+cell+antigen+receptor+to+the+actin+cytoskeleton.">Dynamic molecular interactions linking the T cell antigen receptor to the actin cytoskeleton.</a> Nat. Immunol. 6, 80-89 (2005).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+a+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: a role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action.">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li><li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPs+into+membrane+microdomains+of+live+cells.">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296, 913-916 (2002).</li><li>Adler, J., Parmryd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+colocalization+by+correlation:+the+Pearson+correlation+coefficient+is+superior+to+the+Mander's+overlap+coefficient.">Quantifying colocalization by correlation: the Pearson correlation coefficient is superior to the Mander's overlap coefficient.</a> Cytometry A. 77, 733-742 (2010).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophys. J. 86, 3993-4003 (2004).</li><li>Fang, N., Motto, D. G., Ross, S. E., Koretzky, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosines+113,+128,+and+145+of+SLP-76+are+required+for+optimal+augmentation+of+NFAT+promoter+activity.">Tyrosines 113, 128, and 145 of SLP-76 are required for optimal augmentation of NFAT promoter activity.</a> J. Immunol. 157, 3769-3773 (1996).</li><li>Wunderlich, L., Farag&#243;, A., Downward, J., Buday, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nck+with+tyrosine-phosphorylated+SLP-76+in+activated+T+lymphocytes.">Association of Nck with tyrosine-phosphorylated SLP-76 in activated T lymphocytes.</a> Eur. J. Immunol. 29, 1068-1075 (1999).</li><li>Pauker, M. H., Reicher, B., Fried, S., Perl, O., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cooperation+between+the+proteins+Nck+and+ADAP+is+fundamental+for+actin+reorganization.">Functional cooperation between the proteins Nck and ADAP is fundamental for actin reorganization.</a> Mol. Cell Biol. 31, 2653-2666 (2011).</li><li>Barda-Saad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+at+the+SLP-76+complex+are+critical+for+actin+polymerization.">Cooperative interactions at the SLP-76 complex are critical for actin polymerization.</a> EMBO J. 29, 2315-2328 (2010).</li><li>Pauker, M. H., Hassan, N., Noy, E., Reicher, B., Barda-Saad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Studying the Dynamics of SLP-76, Nck, and Vav1 Multimolecular Complex Formation in Live Human Cells with Triple-Color. 5, rs3 (2012).</li></ol>

Nous n&#39;avons pas de conflits d&#39;intérêts à déclarer.

La régulation et la fonction des multiples processus cellulaires dépendent de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine. Imagerie microscopique permet le suivi en temps réel des protéines marquées par fluorescence dans les cellules vivantes. Colocalisation de protéines marquées peut suggérer une interaction directe ou indirecte entre les protéines, et peut être utilisée pour renforcer les résultats obtenus par des méthodes biochimiques, comme immunoprécipitation. Contrairement aux m...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa human T Cell nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VCA-1002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti CD3 (UCHT1 clone)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>300432</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon FACS Tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30160.03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>345810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>German coverglass system 4 chamber slides</td>
			<td>Lab-Tek II</td>
			<td>155382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Bio Lab</td>
			<td>8410501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-306</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accublock digital dry bath</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>D1105A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5810 R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatable mounting frame - Heating Insert P S</td>
			<td>PeCon</td>
			<td>130-800-031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempModule S (required for the heatable mounting frame)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>411860-9010-000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation device</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence activated cell sorter</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>FACSVantage SE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>7.0.0</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time live imaging of t-cell signaling complex formation

Protection contre les maladies infectieuses est médiée par le système immunitaire de 1,2. Les lymphocytes T sont des coordinateurs de base du système immunitaire, la régulation de l&#39;activation et de réponses des cellules immunitaires multiples 3,4. Activation des lymphocytes T est fonction de la reconnaissance des antigènes spécifiques affichés par des cellules présentatrices d&#39;antigène (CPA). Le récepteur de l&#39;antigène des cellules T (TCR) est spécifique à chacun des clones de cellules T et détermine la spécificité antigénique 5. La liaison du TCR à l&#39;antigène induit la phosphorylation des composants du complexe TCR. Afin de promouvoir l&#39;activation des lymphocytes T, ce signal doit être transduction de la membrane vers le cytoplasme et le noyau, initiant diverses réponses cruciales telles que le recrutement de protéines de signalisation à la TCR, le site APC (la synapse immunologique), leur activation moléculaire, réarrangement du cytosquelette, l&#39;élévation de la concentration de calcium intracellulaire, et les changements dans l&#39;expression des gènes 6,7. L&#39;exactitude deitiation et la cessation des signaux d&#39;activation est essentielle pour les réponses des lymphocytes T appropriés. L&#39;activité des protéines de signalisation dépend de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation des protéines, la formation de complexes protéiques, ubiquitylation de protéines et le recrutement de protéines à différents sites cellulaires 8. Comprendre les rouages ​​du processus d&#39;activation des lymphocytes T est crucial tant pour la recherche immunologique et les applications cliniques. Différents tests ont été développés afin d&#39;étudier les interactions protéine-protéine, mais dosages biochimiques, comme la méthode de co-immunoprécipitation largement utilisé, ne permettent pas lieu de protéines pour être discernée, empêchant ainsi l&#39;observation des indications précieuses sur la dynamique du cellulaire des mécanismes. En outre, ces essais en vrac combinent habituellement des protéines de nombreuses cellules différentes qui pourraient être à différents stades de til a étudié processus cellulaire. Cela peut avoir un effet néfaste sur la résolution temporelle. L&#39;utilisation de l&#39;imagerie en temps réel des cellules vivantes permet à la fois le suivi spatial des protéines et la capacité de distinguer temporellement entre les événements de signalisation, donc faire la lumière sur la dynamique du processus de 9,10. Nous présentons une méthode d&#39;imagerie en temps réel de formation de signalisation complexe lors de l&#39;activation des lymphocytes T. T-cellules primaires ou de lignées de cellules T, telles que Jurkat, sont transfectées avec des plasmides codant pour des protéines d&#39;intérêt fusionnées à des protéines fluorescentes monomères, empêchant oligomérisation non physiologique 11. Vivre les cellules T sont déposés sur une lamelle couvre-objet pré-enduit avec un anticorps d&#39;activation des cellules T 8,9, qui se lie au complexe CD3/TCR, induire l&#39;activation des cellules T, tout en surmontant la nécessité d&#39;antigènes d&#39;activation spécifiques. Les cellules activées sont constamment imagés à l&#39;utilisation de la microscopie confocale. données d&#39;imagerie sont analysés pour donner des résultats quantitatifs, tels que le colcoefficient de ocalization des protéines de signalisation.

Nous présentons un exemple de l&#39;imagerie des cellules T et l&#39;analyse en direct. Avant l&#39;expérience d&#39;imagerie, SLP76 cellules T déficientes (J14) ont été analysés à l&#39;aide de FACS pour déterminer l&#39;expression des protéines fluorescentes (Figure 1). Les cellules T transfectées avec les protéines de signalisation marqués MCFP-NCK et SLP76-mYFP ont été déposés sur des diapositives activation et imagés au cours de T-étalement cellulaire (Figure 2). ...

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Imagerie en direct et en temps réel de la formation du complexe de signalisation des lymphocytes T | Immunologie et infection | Vidéo

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Nous décrivons une méthode d&#39;imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d&#39;activation des lymphocytes T. Nous démontrons l&#39;utilisation combinée de la cellule T test d&#39;épandage, microscopie confocale et analyse d&#39;imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l&#39;activation des lymphocytes T.

En temps réel l&#39;imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

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13.6K vues.  Bar-Ilan University. Nous décrivons une méthode d'imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d'activation des lymphocytes T. Nous démontrons l'utilisation combinée de la cellule T test d'épandage, microscopie confocale et analyse d'imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l'activation des lymphocytes T.

Vidéo: Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Imagerie en temps réel des leucotriènes B 4</subMigration> Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Recherche

Immunologie et infection

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

Imagerie en temps réel des jonctions endothéliales cellule-cellule Pendant neutrophiles Transmigration Sous physiologique débit

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagerie en temps réel des cellules myéloïdes Dynamique<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumeurs par Spinning Disk microscopie confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...