Le métabolisme mitochondrial est un régulateur essentiel de la durabilité et de la mémoire des lymphocytes T. La mesure de la respiration mitochondriale donne donc un aperçu important des propriétés des lymphocytes T. La machine Seahorse peut mesurer divers éléments de la respiration mitochondriale, en temps réel, dans des lymphocytes T primaires humains vivants, sans avoir besoin d’un marquage.
Cette méthode est très appropriée pour surveiller la capacité physique des lymphocytes T et le potentiel de mémoire, qui sont des prédicteurs importants du succès de l’immunothérapie du cancer. Pour commencer, lavez les billes CD3/CD28 en transférant 12,5 microlitres de perles par million de cellules dans un tube de microcentrifugation et en ajoutant 12,5 microlitres de PBS par 12,5 microlitres de perles dans le tube. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation sur un aimant approprié pendant une minute, jetez le tampon et remettez en suspension les billes dans le volume d’origine du milieu cellulaire T.
Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres de perles par million de cellules à un rapport de une à deux perles par cellules, et divisez les cellules en deux conditions avec environ cinq millions de cellules dans chacune. Ensuite, ajoutez le volume correct de cytokines à chaque condition et transférez les cellules sur des plaques multi-puits. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après trois jours d’incubation, préparez un milieu de lymphocytes T frais avec le double de la concentration de cytokines. Resuspendez et divisez les cellules en transférant la moitié du volume de chaque puits dans un nouveau puits. Ensuite, ajoutez le même volume de milieu cellulaire T fraîchement préparé à chaque puits.
Pour le test de flux extracellulaire, préparez une solution de revêtement contenant du bicarbonate de sodium, du Cell-Tak et de l’hydroxyde de sodium. Ensuite, ouvrez une plaque de culture cellulaire XF fraîche et ajoutez 12 microlitres de la solution de revêtement fraîchement préparée à chaque puits, assurant une distribution uniforme de la solution de revêtement au fond de tous les puits. Incuber la plaque à température ambiante avec le couvercle pendant 30 minutes.
Ensuite, jetez la solution liquide restante de tous les puits. Lavez la plaque avec 200 microlitres d’eau stérile et jetez le liquide. Ensuite, lavez la plaque avec 200 microlitres de PBS stérile de qualité culture cellulaire.
Après avoir jeté le liquide, laissez sécher la plaque pendant 30 minutes à température ambiante. Pour plaquer les lymphocytes T dans la plaque de culture cellulaire XF, préparez 50 millilitres de milieux d’essai en mélangeant des milieux XF RPMI appropriés avec du glucose, du pyruvate et de la glutamine selon la configuration expérimentale. Chauffer le milieu préparé à 37 degrés Celsius dans un incubateur non régulé au dioxyde de carbone et régler le pH à 7,4.
Assurez-vous d’avoir suffisamment de milieux pour planter des cellules et préparer les solutions d’olligomycine et de FCCP. Ensuite, concevez une disposition de plaque avec un nombre croissant de cellules par puits pour l’optimisation ou l’exécution du test. Utilisez quatre puits remplis de milieux et injectés avec des milieux pour les mesures de fond.
Après avoir compté les lymphocytes T préparés plus tôt, pipeter un nombre approprié de cellules dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire XF précédemment revêtue en fonction de la disposition de la plaque. Pour faire adhérer les lymphocytes T à la surface revêtue, centrifugez la plaque de culture cellulaire XF. Ensuite, lavez les cellules avec 200 microlitres de milieux d’essai.
Jetez le média et ajoutez 180 microlitres de milieux d’essai frais. Après vous être assuré que les cellules sont fixées et réparties uniformément sur la surface du puits, incuber la plaque de culture cellulaire XF à 37 degrés Celsius dans l’armoire chauffante non régulée au dioxyde de carbone pendant 30 minutes. Pour l’exécution de l’optimisation, préparez des solutions de travail d’oligomycine et de FCCP dans des milieux d’essai.
Ensuite, chargez les solutions de travail d’oligomycine ou de FCCP dans les orifices d’injection de la cartouche du capteur. Assurez-vous qu’aucun orifice d’injection ne contient uniquement de l’air. Remplissez tous les ports vides avec un support de test.
Ensuite, éliminez les bulles potentielles dans les orifices d’injection en frappant doucement les bords de la plaque sur la table. Pour l’essai, préparez une solution d’antimycine A de 20 micromolaires. Ensuite, selon la disposition de la plaque, chargez 20 microlitres d’oligomycine ou de FCCP dans le port d’injection A de la cartouche du capteur et ajoutez 22 microlitres d’antimycine A au port d’injection B de tous les puits.
Dans une série représentative d’optimisation de l’oligomycine, un plateau du taux de consommation d’oxygène, ou OCR, est atteint lorsque la concentration accumulative atteint un micromole. À partir de cette concentration, l’OCR n’a pas été réduite davantage. Pour les cellules traitées avec des concentrations croissantes du fccP découpleur, les niveaux d’OCR ont augmenté jusqu’à 0,2 FCCP micromolaire, puis ont atteint un plateau, indiquant que le découplage complet a été obtenu.
Dans une exécution d’optimisation de la concentration cellulaire représentative, l’OCR initial pour une exécution avec 200 000 cellules est d’environ la moitié de cela, avec 400 000 cellules. Après traitement FCCP, l’OCR maximale est de 61,6 picomoles par minute pour 200 000 cellules et de 190,4 picomoles par minute pour 400 000 cellules. Après un traitement à l’oligomycine, l’OCR dans la course avec 200 000 cellules s’effondre en un seul chiffre et est inférieur à celui de la course avec 400 000 cellules.
L’étude de l’effet des cytokines interleukine-2 et interleukine-15 sur le métabolisme des lymphocytes T a révélé que les cellules cultivées à l’interleukine-15 possédaient une respiration maximale plus élevée et une capacité respiratoire de rechange. Cependant, la respiration basale et la production d’ATP n’ont pas été affectées. L’étude du métabolisme mitochondrial dans les lymphocytes T humains donne des indices importants sur leur durabilité et leur potentiel de survie.
Il en résulte une meilleure connaissance de la condition physique des lymphocytes T et peut finalement améliorer les taux de réponse à l’immunothérapie du cancer.
