Dans le but de réduire les tests sur les animaux et en raison de la variabilité du test nh, l’OMS encourage à développer des approches in vitro pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Ce test ELISA montre une bonne concordance avec un test NH classique dans la reconnaissance de la forme immunogénique de la glycoprotéine, montre une sensibilité élevée, et peut être effectué en seulement une journée. L’évaluation de la puissance vaccinale de la rage in vitro par ELISA est une alternative au test in vivo NH.
Il est promu par les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle. Il est essentiel de distribuer des volumes pré-dimensionnés en double pour chaque dilution et de bien sécher la plaque sur du papier absorbant après les lavages pour éviter de commencer cette procédure, mettre sur un équipement de protection personnelle adéquat, y compris manteau jetable, gants, masque, et des lunettes. Traitez les matières contaminées en les immergeant dans une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 % pendant 30 minutes pour la décontamination.
Ensuite, installez une plaque d’immunoassay de 96 puits et ajoutez 200 microlitres de l’anticorps monoclonal dilués dans le tampon de carbonate à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures dans un environnement humidifié. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez le contenu du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,6 %.
Inverser la microplaque et la laisser sécher sur du papier absorbant à température ambiante pendant cinq minutes. Tout d’abord, ajouter 300 microlitres du tampon de passivation à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après cela, transférer le contenu du puits à celui contenant une solution de 2,6% hypochlorite de sodium. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres du tampon de lavage à chaque puits. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez la teneur du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %.
Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour laver abondamment la plaque sensibilisée. Après cela, inverser la microplaque et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Reconstituer le vaccin de référence dans un millilitre d’eau distillée de telle sorte que la concentration finale de virus de la rage glycoprotéine est de 10 microgrammes par millilitre.
Préparer une dilution 10 fois du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre une concentration de glycoprotéine du virus de la rage d’un microgramme par millilitre. Ensuite, effectuez six dilutions périodiques doubles de ce vaccin de référence dans le diluant tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte. Distribuer 200 microlitres du diluant dans des puits en double pour servir de contrôle aveugle et 200 microlitres par puits pour chaque dilution vaccinale de référence en double.
Préparez ensuite une dilution 10 fois du vaccin testé dans le diluant et préparez sept dilutions en série doubles du vaccin testé en diluant tel que décrit dans le tableau deux du protocole du texte. Distribuez 200 microlitres de chaque dilution vaccinale testée en double à chaque puits de la microplaque. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Après cela, retirez le film. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,7 %. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits, aspirer soigneusement et transférer le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %.
Répétez le processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéine G liées à l’anticorps enduit. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Ensuite, distribuez 200 microlitres de la dilution recommandée de l’anticorps monoclonal D1 étiqueté peroxidase en diluant à chaque puits.
Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %. Pour laver la microplaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits.
Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite à 2,6 % de sodium. Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute.
Ensuite, distribuez 200 microlitres de solution substrat-chromogène dans chaque puits. Sceller la microplaque avec du film et l’incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.
Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-le dans le spectrophotomètre. Déterminer la densité optique à 492 nanomètres pour tous les puits utilisés. Collectez ces données dans un fichier de feuille de calcul pour analyse.
Après cela, créez des parcelles pour la courbe vaccinale de référence et les valeurs de densité optique décrites dans le protocole textuel. Dans cette étude, le test ELISA in vitro est utilisé pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Des valeurs de densité optique représentatives d’une expérience typique sont affichées ici.
Ces valeurs sont utilisées pour dessiner la courbe vaccinale de référence en traçant la densité optique moyenne pour les différentes dilutions du vaccin de référence sur l’axe vertical et la concentration de la glycoprotéine sur l’axe horizontal. La teneur en glycoprotéines du vaccin testé est ensuite estimée à l’aide de cette courbe. L’évaluation est précise pour les dilutions qui ont une valeur moyenne de densité optique dans la zone du revêtement de la courbe vaccinale de référence.
Compte tenu de la dilution de un à 40, la projection verticale de l’OD 1534 sur l’axe x correspond à 500 nanogrammes par millilitre. Ainsi, le vaccin testé est estimé à 20 microgrammes par millilitre de glycoprotéine. Lorsque la puissance in vitro est établie, il est nécessaire de comparer le vaccin testé à la référence six normes internationales de l’OMS calibrées dans des unités internationales.
La même méthode peut être utilisée avec d’autres anticorps pour élargir la détection d’un plus grand nombre de souches vaccinal, y compris celles utilisées dans les vaccins vétérinaires qui sont classiquement plus variables. Les anticorps peuvent également être utilisés en compétition pour la titration d’anticorps antirabies dans le sérum équin ou humain. Des précautions doivent être prises avec des vaccins qui ne sont pas inactivés ou avec des virus.
Assurez-vous d’utiliser de l’équipement de protection individuelle, de porter des gants et de tout décontaminer correctement. Aussi, soyez prudent avec les comprimés de car ils sont cancérigènes et avec la solution acide d’hypochlorite de sodium.
