Este RT-PCR em tempo real é adequado para diagnosticar rapidamente a raiva em amostras pré-mortem e pós-morte. Os primers Pan-Lyssavirus foram otimizados para identificar todos os membros do gênero Lyssavirus. Este é um ensaio rápido, sensível e de tubos fechados que detecta vírus de todo o gênero Lyssavirus, incluindo espécies altamente divergentes de espécimes clínicos.
A OIE recentemente aceitou ensaios moleculares para relatar infecção por raiva. Isso é particularmente importante para espécimes decompostos que nem sempre podem ser diagnosticados por métodos de detecção de vírus ou antígenos. Devido à sensibilidade deste ensaio, uma boa prática laboratorial, incluindo a separação dos diferentes estágios, é vital para minimizar o risco de contaminação.
Demonstrando o procedimento será Daisy Jennings, uma diagnóstica do meu laboratório. Comece quantificando o RNA com um espectrômetro de micro volume. Certifique-se de que a máquina está configurada para RNA e use um a dois microliters de água de grau molecular para normalizar a máquina e estabelecer uma linha de base.
Meça a concentração de RNA e ajuste-a a um micrograma por microlitera. Planeje o layout da sua placa PCR com uma planilha levando em conta as amostras de teste e controle. Prepare uma estação de trabalho PCR desinfetando superfícies e se usar um gabinete UV, ligue a luz UV 10 minutos antes de iniciar.
Remova reagentes e primers do congelador para descongelar, mas mantenha a mistura de enzimas no gelo o tempo todo. Misture os reagentes e a centrífuga brevemente para coletar o líquido. Prepare as misturas mestres pcr para Lyssavirus e Beta-Actin de acordo com as instruções do manuscrito.
Deixe as misturas mestres no gelo até estar pronto para usar. Misture e centrifufique as misturas mestre preparadas e distribua 19 microliters nos poços relevantes da placa compatível com a máquina PCR ou tira de tubo. Em uma sala separada ou um gabinete UV, adicione cuidadosamente um microliter do RNA preparado.
Se usar um gabinete UV, ligue a luz UV 10 minutos antes de começar. Após as amostras de teste, adicione o controle positivo e o controle sem modelo. Ao adicionar o RNA às misturas mestres, certifique-se de que ele é adicionado ao bem correto.
Use um plano de placa para ajudar nesta etapa. Sele a placa verificando se as tampas estão planas através da placa e gire-a para baixo para coletar todo o líquido na parte inferior dos poços. Certifique-se de que cada poço tenha o mesmo volume de líquido e nenhuma bolha seja visível.
Em seguida, transfira as amostras para a máquina PCR. Abra o programa escolhendo sybr green com dissociação. Selecione os poços a serem analisados escolhendo desconhecidos como o tipo de amostra e SYBR como o corante fluorescente.
Rotule os poços no layout da placa com as informações da amostra, incluindo se o ensaio é para Lyssavirus L ou Beta-Actin. Clique na configuração do perfil termo e modifique as condições de ciclismo térmico conforme especificado no manuscrito. Clique em iniciar e escolha um local para salvar o arquivo e marque a caixa para desligar a lâmpada no final da execução.
Quando a opção de iniciar antes do aquecimento da lâmpada aparecer, clique em rodar agora, mas certifique-se de que a lâmpada tem menos de 15 minutos para aquecer. Quando a execução do PCR estiver concluída, proceda com a análise dos dados. Primeiro, analise os gráficos de amplificação do Lyssavirus.
Amostras positivas apresentam rampas exponenciais, enquanto amostras negativas têm parcelas planas de amplificação sem valores de tomografia computadorizada. Em seguida, analise os resultados da curva de dissociação do Lyssavirus das amostras de teste ao lado das amostras de controle. Uma amostra positiva do Lyssavirus terá uma temperatura de fusão entre 77 e 80 graus Celsius e se sobreporá ao controle positivo.
Em seguida, analise as parcelas de amplificação Beta-Actin e as curvas de dissociação comparando com os controles para interpretar o resultado geral. Veja o relatório de texto e use os detalhes para registrar os valores CT e TM obtidos para o RNA de controle em um cartão de controle para confirmar que a execução foi bem sucedida e que os resultados da amostra de teste podem ser relatados. Este protocolo é usado para demonstrar a sensibilidade do Pan-Lyssavirus RT-PCR em uma série de diluição de RNA de um vírus padrão de controle.
A curva de amplificação indica que apenas 10 picogramas de Lyssavirus podem ser detectados e as curvas de dissociação verificam a temperatura de fusão do produto. A temperatura de fusão é usada para confirmar que a amplicon é específica do Lyssavirus. Os resultados aqui demonstram uma faixa de temperatura de fusão em todo o gênero Lyssavirus de 77,34 a 79,67 graus Celsius.
Os valores de temperatura de fusão abaixo de 76,8 ou acima de 80,2 são considerados não específicos. A sensibilidade deste ensaio RT-PCR também é determinada pela detecção de RNA de três amostras cerebrais positivas do Lyssavirus. Apenas 0,1 picogramas por microliter de RNA alvo podem ser detectados para duas das três amostras.
Notavelmente, representantes de todas as espécies reconhecidas do Lyssavirus são detectados usando este ensaio. Se analisar extratos de RNA de amostras clínicas como saliva ou CSF, os resultados da Beta-Actin podem ser negativos devido à falta de ácidos nucleicos hospedeiros. A adição de um controle exógeno pode resolver esse problema.
Recomenda-se o sequenciamento de amostras positivas de Lyssavirus para fornecer informações adicionais sobre as origens geográficas e hospedeiras de uma infecção antirrábica. O manuseio de amostras positivas positivas ou suspeitas de Lyssavirus deve estar de acordo com as diretrizes locais de saúde e segurança. O RNA extraído não é infeccioso, portanto pode ser manuseado em laboratórios de baixa contenção.
