Com o objetivo de reduzir os testes em animais e por causa da variabilidade do teste de NH, a OMS incentiva a desenvolver abordagens in vitro para avaliar a potência da vacina antirrábica. Este teste ELISA mostra uma boa concordância com um teste clássico de NH no reconhecimento da forma imunogênica da glicoproteína, mostra uma alta sensibilidade, podendo ser realizado em apenas um dia. A avaliação da potência da vacina antirrábica in vitro pela ELISA é uma alternativa ao teste in vivo NH.
É promovido pelos fabricantes e laboratórios nacionais de controle. É fundamental distribuir volumes pré-dimensionados em duplicação para cada diluição e secar bem a placa em papel absorvente após lavagens Para evitar Para iniciar este procedimento, coloque equipamentos de proteção pessoal adequados, incluindo casaco descartável, luvas, máscara e óculos. Trate os materiais contaminados imergindo-os em uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6% por 30 minutos para descontaminação.
Em seguida, estabeleça uma placa de imunoensaio de 96 poços e adicione 200 microliters do anticorpo monoclonal diluído no tampão de carbonato a cada poço. Cubra a placa com filme adesivo e incubar a microplacão a 37 graus Celsius por três horas em um ambiente umidificado. Em seguida, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.
Inverta a microplacão e deixe secar em papel absorvente à temperatura ambiente por cinco minutos. Primeiro, adicione 300 microliters do buffer de passivação a cada poço. Cubra a placa com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Depois disso, transfira o conteúdo do poço para um contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%. Para lavar a placa, adicione 300 microliters do tampão de lavagem a cada poço. Em seguida, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo do poço para um destinatário contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.
Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para lavar extensivamente a placa sensibilizada. Depois disso, inverta a microplacão e deixe-a secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto. Reconstitua a vacina de referência em um mililitro de água destilada de tal forma que a concentração final do vírus da raiva glicoproteína é de 10 microgramas por mililitro.
Prepare uma diluição 10 vezes da vacina de referência reconstituída no diluente para atingir a concentração de glicoproteína do vírus da raiva de um micrograma por mililitro. Em seguida, realize seis diluições em série duas vezes desta vacina de referência no diluído, conforme descrito na tabela um do protocolo de texto. Distribua 200 microlitres do diluído em poços duplicados para servir como controle cego e 200 microliters por poço para cada diluição vacinal de referência em duplicata.
Em seguida, prepare uma diluição 10 vezes da vacina testada no diluído e prepare sete diluições seriais duplas da vacina testada em diluente, conforme descrito na tabela dois do protocolo de texto. Distribua 200 microlitadores de cada diluição vacina testada em duplicação para cada poço da microplacão. Cubra a microplacão com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por uma hora.
Depois disso, remova o filme. Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,7%. Para lavar a placa, adicione 300 microliters de tampão de lavagem a cada poço, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um recipiente contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%.
Repita o processo de lavagem mais cinco vezes para remover o antígeno desvinculado e conservar os aparadores de proteína G ligados ao anticorpo revestido. Inverta a microplacão lavada e deixe secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto. Em seguida, distribua 200 microliters da diluição recomendada de peroxidase rotulado anticorpo monoclonal D1 em diluente para cada poço.
Cubra a microplacão com filme adesivo e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, remova o filme, aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo uma solução de hipoclorito de sódio de 2,6%. Para lavar a microplacão, adicione 300 microliters de tampão de lavagem a cada poço.
Aspire cuidadosamente e transfira o conteúdo de cada poço para um receptor contendo 2,6% de solução de hipoclorito de sódio. Repita este processo de lavagem mais cinco vezes para remover o anticorpo rotulado peroxidase não ligado. Inverta a microplacão lavada e deixe secar em um pedaço de papel absorvente à temperatura ambiente por um minuto.
Em seguida, distribua 200 microliters de solução substrato-cromógeno em cada poço. Sele a microplacão com filme e incubar à temperatura ambiente no escuro por 30 minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de solução de parada em cada poço para parar a reação.
Limpe cuidadosamente a parte inferior da microplacão e coloque-a no espectotúmetro. Determine a densidade óptica em 492 nanômetros para todos os poços utilizados. Colete esses dados em um arquivo de planilha para análise.
Depois disso, crie gráficos tanto para a curva de vacina de referência quanto para os valores de densidade óptica descritos no protocolo de texto. Neste estudo, o teste ELISA in vitro é utilizado para avaliar a potência da vacina antirrábica. Valores de densidade óptica representativos de um experimento típico são mostrados aqui.
Esses valores são utilizados para desenhar a curva de vacina de referência, traçando a densidade óptica média para as diferentes diluições da vacina de referência no eixo vertical e a concentração da glicoproteína no eixo horizontal. O teor de glicoproteína da vacina testada é então estimado usando esta curva. A avaliação é precisa para diluições que tenham um valor médio de densidade óptica na área do forro da curva de vacina de referência.
Levando-se em conta a diluição de um a 40, a projeção vertical de OD 1534 no eixo x corresponde a 500 nanogramas por mililitro. Assim, a vacina testada é estimada em 20 microgramas por mililitro de glicoproteína. Quando a potência in vitro é estabelecida, é necessário comparar a vacina testada com a referência de seis padrões internacionais da OMS calibrados em unidades internacionais.
O mesmo método pode ser usado com outros anticorpos para ampliar a detecção de mais cepas de vacinas, incluindo aquelas usadas em vacinas veterinárias que são classicamente mais variáveis. Anticorpos também podem ser usados na competição para titulação de anticorpos antirrábios em equinos ou soro humano. Precauções devem ser tomadas com vacinas que não estão inativadas ou com vírus.
Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual, usar luvas e descontaminar tudo corretamente. Além disso, tenha cuidado com comprimidos de como são cancerígenos e com a solução de hipoclorito de sódio ácido.
