Name: generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par des subventions de la Fondation Michael J. Fox, de l’Institut national des troubles neurologiques et des AVC (NS099416) et du Weston Brain Institute.

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	<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice.">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity.">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li><li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration.">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li><li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration.">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration.">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129 (2018).</li><li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+Over+Quantity:+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson's+Disease.">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621 (2018).</li><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells.">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death.">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li><li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates.">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li><li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies.">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li><li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies.">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li><li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson's+disease.">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li><li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain.">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12 (2017).</li><li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson's+Disease+in+Rodents.">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li><li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson's+disease.">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li><li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein,+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces.">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788 (2018).</li><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li><li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation.">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li><li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons.">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li></ol>

Joseph Patterson, Kelvin Luk et Caryl Sortwell sont actuellement impliqués dans des arrangements contractuels avec la Fondation Michael J. Fox pour le contrôle de la qualité α-syn matériel généré par Proteos, Inc Coauthor Nicole Polinski, est un employé de la Michael J. Fox Fondation, qui a contracté Proteos, Inc. pour produire de l’α-syn monomère. Les coauteurs Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley et Nicholas Kanaan n’ont rien à divulguer.

La production de PFFs α-syn capables d’ensemencer des neurones et conduisant à des inclusions de corps-like Lewy dépend de plusieurs facteurs et étapes. Un facteur essentiel est que les monomères utilisés pour produire des fibrilles doivent être formulés spécifiquement pour la fibrilisation4,9,14,15. Si les monomères ne sont pas formulés pour la fibrilisation, les fibrilles ne peuvent pas se former ou les fibrilles qui ne forment pas peuvent produire une pathologie α-syn. De même, le tampon que les monomères influencent également la fibrilisation. À ce titre, pour obtenir les meilleurs résultats, la concentration de sel doit être d’environ 100 mM de NaCl et de pH entre 7,0 et 7,3. Une première étape qui introduit la variabilité est la méthode par laquelle la teneur initiale en protéines est déterminée, avec une mesure à A280 susceptibles de produire des résultats plus précis et est donc la méthode préférée. L’écart dans la concentration de protéines peut diminuer l’efficacité du processus de fibrilisation, ainsi que modifier la concentration supposée de PFF utilisée dans les expériences. Les deux pourraient entraîner une diminution de l’efficacité des semis et de la variation des lots entre les expériences.
Les mesures initiales de contrôle de la qualité confirmeront les caractéristiques critiques des PFFS, en particulier qu’elles ont une conformation fibrillaire (microscopie électronique), contiennent des structures amyloïdes (dosage de la thioflavine T) et sont partir (dosage de la sédimentation). Il est important de noter que les résultats du dosage de la thioflavine T fluctueront avec le temps et ne sont pas une mesure directe de la quantité de structures amyloïdes présentes, plutôt, le dosage de la thioflavine T ne doit être utilisé que comme un indicateur de la présence de structures amyloïdes dans l’échantillon. La thioflavine T est généralement utilisée dans les essais in vitro, tels que le dosage susmentionné pour montrer que les fibrilles contiennent des structures amyloïdes. Alternativement, la thioflavine S est utilisée dans le tissu pour détecter les structures amyloïdes, comme le montre la figure 7. En ce qui concerne le dosage de la sédimentation, les résultats montrent seulement que les PFFS se trouvent principalement dans la fraction partir. Comme les échantillons sont exécutés dans des conditions de dénaturation, une seule bande proéminente d’environ 14 kDa, la taille des monomères α-syn, est présente sur les gels. C’est à la différence des bandes multiples présentes à des poids moléculaires plus élevés qui seraient attendus avec des PFFs si un gel natif ou non dénaturant a été utilisé. Enfin, la réussite de toutes ces étapes initiales de contrôle de la qualité ne garantit pas l’activité d’ensemencement de l’inclusion α-syn. Pour cette raison, des expériences de culture cellulaire ou une petite cohorte d’animaux injectés chirurgicalement devraient être utilisées pour tester l’efficacité des PFFs avant utilisation dans des expériences plus larges.
Sonication est une étape cruciale dans le processus et les paramètres différeront selon le modèle de sonicateur utilisé. Les paramètres de sonication doivent être appliqués et vérifiés pour montrer que des fragments de PFF courts ont été produits. La taille des fibrilles a un rapport avec l’ensemencement, avec des semis plus courts plus efficacement. Bien que les semences plus courtes fibrilles plus efficacement, cet effet plateaux et la longueur optimale PFF est d’environ 50 nm4,18. Il est également important de ne pas sur-sonicate les échantillons et exposer les PFFs à la chaleur excessive, car cela peut diminuer l’efficacité des semis. Ces PFFS soniqué doivent être testés pour l’efficacité dans la culture de petites cellules ou des expériences in vivo avant d’utiliser dans des expériences à plus grande échelle. Comme différentes séances de sonication ont le potentiel d’introduire la variabilité, les groupes de traitement expérimental devraient être planifiés en conséquence.
Lors de la livraison de PFFS in vivo, la localisation du ou des sites d’injection et la quantité totale de PFFS utilisés peuvent affecter le nombre de neurones qui développeront des inclusions ainsi que l’étendue de la neurodégénérescence7,14. Les coordonnées dans le protocole fournissent un endroit pour commencer, mais doivent être testées dans le laboratoire pour s’assurer que la région cible souhaitée développe la pathologie α-syn avant d’utiliser dans des expériences à grande échelle. Si désiré, le suivi de colorant ou de billes fluorescentes peut être utilisé comme un moyen de tester le ciblage régional avant d’utiliser des PFFs. La quantité de PFFS utilisé in vivo varie entre les groupes, la plupart des groupes utilisant un total compris entre 5 et 20 μg de PFFS à un ou divisé entre deux sites d’injection1,2,3,4,5 , le 6 , le 7 , 14. comme le nombre de sites d’injection, l’emplacement des sites d’injection, et la quantité de PFFS injectés peuvent affecter les résultats et la progression de la synucléinopathie, les résultats en aval des paramètres utilisés doivent être caractérisés avant d’utiliser le modèle pour tester les interventions potentielles ou examiner les caractéristiques temporelles du modèle.
Lors de la sélection d’un modèle à utiliser pour tester des thérapies ou étudier la progression de la maladie, le modèle utilisé doit être sélectionné pour répondre au mieux à la question posée. Tous les modèles ne posséderont pas certaines caractéristiques pathodynamiques de la maladie ou offriront le délai nécessaire pour tester les interventions potentielles. Le modèle de PFF récapitule les principales caractéristiques de la DP, telles que la pathologie α-syn et la neurodégénérescence, et peut conduire à des déficiences motrices modestes. Le modèle offre un temps-cours prévisible et prolongé, où les inclusions forment des mois avant la neurodégénérescence. Cela permet aux chercheurs d’examiner et d’exploiter les différentes phases tout au long de la progression prolongée de la synucléinopathie. L’utilisation actuelle et future du modèle global devrait être bénéfique dans l’étude de la progression de la maladie et du développement de nouvelles thérapies.

La maladie de Parkinson (MP) est principalement caractérisée post-mortem par deux caractéristiques pathologiques majeures: la pathologie généralisée et progressive de l’alpha-synucléine (α-SYN), et la dégénérescence nigrostriatale. Après l’injection dans des souris ou des rats sauvages, les fibrilles α-syn préformées (PFFs) induisent une accumulation progressive de α-syn pathologique, ce qui peut entraîner une dégénérescence prolongée des neurones de la dopamine de substantia nigra pars compacta (SNpc) au cours de plusieurs mois, ainsi que les déficits sensorimoteurs1,2,3,4,5,6. Les neurones sont exposés à des fibrilles α-syn, soit par injection intracérébrale directe, soit ajoutées aux milieux des neurones cultivés. Lorsque les PFFS sont pris dans les neurones, les PFFS agissent pour «semer» la formation d’inclusions par le biais de modèles, et l’accumulation d’α-syn endogène dans les inclusions phosphorylées1,7,8, le 9. Les inclusions partagent des propriétés similaires aux corps de Lewy: contenant de l’α-syn phosphorylée à la sérine 129 (pSYN), à l’ubiquitine et à la p62; posséder des structures quaternaires amyloïdes, comme le montre la coloration positive de la thioflavine; et résistent à la digestion de la protéinase K1,3,5,7,8,9,10,11, le 12. L’exposition au PFF conduit à la formation de l’inclusion α-syn dans les neurones primaires et certains neuronaux immortalisés dans la culture, ainsi que chez les souris, les rats et les primates non humains in vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. Il est important de noter que les PFFs ne mèneront pas à la formation d’inclusion α-syn dans tous les modèles de culture cellulaire et que certains neurones cultivés seront mieux semences que d’autres.
Une autre caractéristique importante du modèle in vivo α-syn PFF est les phases pathologiques séquentielles distinctes qui émergent sur plusieurs mois. Chez les rongeurs, après l’injection intrastriatale, la formation d’inclusion α-syn atteint généralement des pics dans le SNpc et dans de nombreuses régions corticales dans les 1-2 mois. Ce pic d’agrégation est suivi de la dégénérescence nigrostriatale ≈ 2-4 mois plus tard1,3,5. Ces stades pathologiques distincts fournissent aux chercheurs la plate-forme pour étudier et développer des stratégies qui 1) diminuent l’agrégation α-syn, 2) des inclusions α-syn déjà formées et/ou 3) empêchent la neurodégénérescence subséquente. Le modèle PFF offre des avantages et des inconvénients distincts par rapport aux modèles de surexpression α-syn à médiation virale, transgénique et neurotoxicant, tels que examinés précédemment6. Le choix du modèle ou de l’approche à adopter devrait être déterminé par le modèle qui convient le mieux à la question que les enquêteurs demandent.
Bien que le modèle de PFF ait été utilisé avec succès par de nombreux laboratoires, il existe encore des groupes qui ont connu des incohérences avec la production de fibrilles et la production d’une pathologie α-syn cohérente14. Des exemples d’incohérences vont des PFFs qui produisent peu ou pas de pathologie α-syn, l’efficacité de l’ensemencement par lots, et même l’échec des fibrilles à se former. Ainsi, la normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin de permettre des interprétations exactes de l’impact des nouvelles interventions thérapeutiques. Le protocole suivant décrit les étapes requises pour la génération de PFFs à partir de monomères α-syn, le contrôle de qualité in vitro des PFFs une fois formés, la sonication et la mesure des PFFs avant l’utilisation, et des suggestions pour faciliter l’injection in vivo réussie de PFFs en rats ou en souris.

<table >
	<tbody>
		<tr >
			<td >1x Dulbecco's phosphate buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher (Gibco)</td>
			<td >14190144</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein (phosphorylated at serine 129) antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB184674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-alpha-synuclein antibody</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >AB15530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bicinchonic acid</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.036" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Medical Shrink Tubing (0.044" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Copper sulfate</td>
			<td >Thermo Fisher (Pierce)</td>
			<td >PI23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >2231000574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Eppendorf ThermoTop heated lid</td>
			<td >Eppendorf</td>
			<td >5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formvar/Carbon coated electron microscopy grids</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >FCF300-Cu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass capillary tube (0.53 mm outer diameter; 0.09 mm inner diameter; 54 mm length)</td>
			<td >Drummond</td>
			<td >22-326223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass needle puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hamilton syringe</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td >80000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse alpha-synuclein monomer to generate preformed fibrils</td>
			<td >Proteos</td>
			<td >RP-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orange Medical Shrink Tubing (0.021" inner diameter)</td>
			<td >Nordson Medical</td>
			<td >103-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Parafilm M</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P7543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proteinase K</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >25530015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica 3.2 mm tip</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >4422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Qsonica Q125 sonicator</td>
			<td >Qsonica</td>
			<td >Q125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thioflavin S</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >T1892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td>Thioflavin T</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >596200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit</td>
			<td >Genscript</td>
			<td >L00350C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Uranyl acetate</td>
			<td >Eletron Microscopy Sciences</td>
			<td >22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of alpha-synuclein preformed fibrils from monomers and use in vivo

L’utilisation de l’alpha-synucléine in vivo du modèle préformé de fibrilles (α-syn PFF) de la synucléinopathie gagne en popularité parmi les chercheurs visant à modéliser la synucléinopathie de la maladie de Parkinson et la dégénérescence nigrostriatale. La normalisation de la génération de PFF α-syn et de l’application in vivo est essentielle afin d’assurer une pathologie α-syn cohérente et robuste. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la génération de fibrilles à partir des étapes monomères α-syn, post-fibrilisation de contrôle de qualité, et suggéré des paramètres pour l’injection neurochirurgicale réussie de PFFs α-syn dans des rats ou des souris. En commençant par l’α-syn monomérique, la fibrilisation se produit sur une période d’incubation de 7 jours tout en secouant à des conditions de tampon optimales, la concentration et la température. Le contrôle de la qualité post-fibrilisation est évalué par la présence de fibrilles partir par dosage de sédimentation, la formation de conformation amyloïde dans les fibrilles avec un dosage de thioflavine T, et la visualisation microscopique des fibrilles par microscopie électronique. Alors que la validation réussie à l’aide de ces essais est nécessaire pour le succès, ils ne sont pas suffisants pour garantir que les PFFs ensemencer des inclusions α-syn dans les neurones, car cette activité d’agrégation de chaque lot de PFF doit être testée dans la culture cellulaire ou dans les cohortes animales pilotes. Avant l’utilisation, les PFFs doivent être sonicés dans des conditions parfaitement normalisées, suivies d’un examen à l’aide de la microscopie électronique ou de la diffusion dynamique de la lumière pour confirmer que les longueurs de fibrilles sont dans une plage de taille optimale, avec une longueur moyenne de 50 nm. Les PFFs peuvent ensuite être ajoutés aux milieux de culture cellulaire ou utilisés chez les animaux. La pathologie détectable par immunocoloration pour l’α-syn phosphorylée (pSYN; sérine 129) est apparente jours ou semaines plus tard dans la culture cellulaire et les modèles de rongeurs, respectivement.

La génération de fibrilles de monomères α-syn commence par la détermination de la concentration des monomères. Le dosage de la BCA et la mesure de l’absorbance à 280 nm (A280) peuvent être utilisés pour mesurer la teneur en protéines; les résultats de l’analyse BCA, cependant, suggèrent une concentration plus élevée que la méthode A280. Les PFFs dérivés du monomère α-syn de la souris ont une valeur de BCA de 14,05 ± 0,22 et un A280 de 8,05 ± 0,03 μg/μL (figure 1). De même, les PFFs dérivés du monomère α-syn humain semblaient également être à une concentration plus élevée, avec une valeur de BCA de 12,95 ± 0,38 et un A280 de 7,83 ± 0,05 μg/μL (figure 1). Les mesures A280 sont spécifiques à α-SYN en fonction de l’inclusion des coefficients d’extinction et ces résultats ont été utilisés pour diluer les monomères avant l’incubation de 7 jours.
Avant l’incubation, le liquide contenant les monomères α-syn était clair, mais il devrait apparaître trouble après la formation de fibrilles. L’examen par microscopie électronique à transmission confirme la présence de fibrilles longues mesurant 10-20 nm de large (figure 4). En comparaison, les monomères α-syn étaient à peine visibles, sans forme apparente (figure 4). Avec la confirmation visuelle des structures fibrillaires, la conformation amyloïde des fibrilles est la prochaine caractéristique des PFFs qui devrait être confirmée à l’aide d’un dosage de thioflavine T. La thioflavine T présente une fluorescence accrue lorsqu’elle se lie à l’amyloïde; ainsi, l’augmentation du signal fluorescent des échantillons indique la présence d’amyloïde. À titre d’exemple, la thioflavine dans les dPBS a produit un signal de 3 287 ± 580 unités fluorescentes relatives (RFU), le monomère α-syn de souris a produit un signal de 4 174 ± 158 RFU, et les PFFs de souris ont produit un signal de 59 754 ± 6 224 RFU (figure 5). En comparaison, le monomère α-syn humain a produit un signal similaire de 4 158 ± 105 RFU au monomère de souris, et les PFFs humains ont produit un signal plus élevé de 1 235 967 ± 113 747 RFU par rapport aux PFFs de souris (figure 5). Pour évaluer la présence de fibrilles partir, un dosage de sédimentation a été effectué. Les fibrilles vont granule avec centrifugation. Dans les échantillons de la souris et du PFF humain, la fraction surnageante devrait avoir plus de protéines dans le culot que le surnageant (figure 6). En revanche, la majorité de la protéine de la souris et des monomères humains était présente dans le surnageant, avec peu de présent dans la granule (figure 6). Avec les PFFs visiblement présents par microscopie électronique, les structures amyloïdes présentes et les fibrilles pelletable, les PFFs ont passé toutes les étapes de contrôle de la qualité in vitro.
La souris et les PFFS humains ont été soniqué pour produire des PFFS de longueurs appropriées pour ensemencer des inclusions α-syn4,18. Les PFFs ont été dilués à la concentration désirée de 4 μg/μL et sonication. Immédiatement avant la chirurgie, 25 fibrilles représentatives ont été imagées par microscopie électronique et mesurées pour vérifier la taille du fibrille. Les PFFS de souris soniqué ont mesuré 48,8 ± 3,1 nm, alors que les PFFS humains ont mesuré 52,1 ± 4,4 nm de longueur; Les PFFs des deux espèces étaient donc la longueur appropriée (50 nm ou moins) pour induire l’activité d’ensemencement. Un examen plus approfondi d’environ 500 fibrilles a révélé la longueur moyenne et la longueur de la distribution des fibrilles de souris soniqué. La longueur moyenne était de 44,4 ± 0,6 nm, avec 86,6% des PFFs mesurant 60 nm ou moins (figure 4). En comparaison, les PFFs humains se sont établis en moyenne à 55,9 ± 1,1 nm avec 69,6% des PFFs mesurant 60 nm ou moins (figure 4).
Après l’injection intrastriatale de PFFS de souris soniqué dans des rats comme décrit précédemment3,5, une série de sections tissulaires ont été traitées à 2 mois après la chirurgie, lorsque le nombre d’inclusion contenant des neurones est connu pour culminé dans le SNpc, pour la confirmation des inclusions α-syn phosphorylées5. Les neurones porteurs d’inclusion, comme indiqué par la coloration immunohistochimique pour le pSyn (anticorps dans la table des matières), sont présents dans le SNPC (figure 7), ainsi que dans d’autres régions du cerveau qui innervent le striatum (antérieur noyau olfactif, moteur, cingulate, piriforme, prélimbique, somatosensoriel, entorhinal et cortices insulaires, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Ces inclusions partagent des propriétés similaires avec des corps Lewy, tels que la liaison de la thioflavine S, et la résistance de l’α-syn total à la protéinase K (figure 7), comme le montre la coloration immunohistochimique (anticorps et protéinase k dans la table des matières) . La confirmation de l’ensemencement dans le cerveau indique que le contrôle de qualité in vivo a été passé, et les aliquotes des PFFs précédemment congelés et sauvés du même lot peuvent être sonicés sous des paramètres identiques, avec des longueurs validées, dans des expériences plus larges.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Figure 1 . Méthodes pour la génération de fibrilles α-syn. Aperçu des étapes requises pour produire des fibrilles à partir de monomères α-syn. Les monomères sont centrifugés pendant 10 min (15 000 x g, à 4 ° c). Le surnageant est transféré dans un tube propre et la concentration protéique est déterminée soit par l’absorbance à 280 nm, soit par un dosage BCA. Le graphique montre les concentrations des monomères α-syn humains et de souris. Les colonnes indiquent les moyennes de groupe, les barres d’erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Après avoir déterminé la concentration en protéine, les monomères α-SYN sont dilués, brièvement vortexés et incubés pendant 7 jours pour 37 ° c, tout en secouant sur un mélangeur orbital réglé à 1 000 rpm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> La figure 2 . Méthodes de coloration pour la microscopie électronique par transmission. Diagramme de coloration négative pour la microscopie électronique. A) images illustrant des grilles d’échantillons de microscopie électronique. La grille a un côté terne ou léger et un côté brillant ou sombre. Le côté brillant/sombre est recouvert d’un film de support formvar/Carbon. B) illustration de la procédure de coloration. La grille est flottée côté brillant/sombre vers le bas sur la première goutte de FD2O pendant 1 min et l’excès est méchant loin avec du papier filtre. Le processus est répété avec la deuxième goutte de FD2o, les PFFS dilués ou les monomères, deux gouttes d’acétate d’uranyle et deux gouttes supplémentaires de DDH2o. les grilles peuvent être stockées dans une boîte de grille jusqu’à ce qu’elles soient imagées. Barre d’échelle = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Figure 3 . Assemblage de seringues à aiguilles en verre sur mesure. Schéma des étapes requises pour assembler les seringues attachées à l’aiguille en verre. Les tubes capillaires en verre siliconisé sont tirés et coupés au milieu pour produire des aiguilles en verre. Le tube rétractable est utilisé pour préparer l’aiguille en métal et former un joint intérieur lorsque l’aiguille en verre est glissade sur l’aiguille en métal. Deux couches additionnelles de tubes rétractables qui chevauchent la base de l’aiguille en verre et l’aiguille en métal sont ajoutées consécutivement et la chaleur appliquée pour fixer l’aiguille en verre et former un joint étanche à l’eau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Figure 4 . Visualisation des monomères α-syn et des fibrilles α-syn par microscopie électronique à transmission. Micrographies représentatives des monomères α-syn et des fibrilles. Panneaux supérieurs: souris et humain α-syn monomère. Panneaux du milieu: souris pleine longueur et PFFs α-syn humains. panneaux inférieurs: souris et humains α-syn PFFs après sonication. Graphique du bas: distribution de la souris soniqué et des longueurs de PFF α-syn humaines. Barre d’échelle = 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Figure 5 . Confirmation des structures amyloïdes par dosage de thioflavine T. Mesure du signal fluorescent à partir d’échantillons de souris et de monomère α-syn humain et de PFF. Gauche: résultats des monomères α-syn de souris et des PFFs α-syn. Droite: résultats des monomères α-syn humains et des PFFs α-syn. Un contrôle négatif dPBS est affiché dans chaque graphe. Toutes les mesures sont exprimées en unités fluorescentes relatives (RFU). Les colonnes indiquent les moyennes de groupe, les barres d’erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Figure 6 . Dosage de la sédimentation pour la partir α-syn. images de gels colorés de Coomassie. Les bandes montrées sont à environ 14 kDa en fonction de l’échelle protéique. Gauche: souris monomère et PFFs. A droite: monomères et PFFs humains. Pour tous les échantillons de monomère et de PFF, on montre le culot (P) et le surnageant (S) resuspendus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Figure 7 . Caractéristiques des inclusions dans le modèle de rat confirmant la pathologie α-syn. Micrographies représentatives de la substantia nigra pars compacta à 2 mois après l’injection. Gauche: neurones contenant pSyn et contre-teinté avec le violet de cresyle. Milieu: neurones positifs de la thioflavine S. Droite: inclusions contenant de l’α-syn résistantes à la protéinase K. barre d’échelle = 50 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Le modèle Fibril préformé Alpha-Synuclein est utilisé par les laboratoires du monde entier pour étudier les synucleinopathies. Bien que le modèle ait été utilisé avec succès par de nombreux laboratoires, certains groupes ont connu des incohérences générant des fibrilles et produisant une pathologie alpha-synucléine cohérente. Nous espérons que ce protocole, qui détaille la génération de fibrilles à partir de monomères alpha-synucléine et l’utilisation de fibrilles pré-formés in vivo, peut répondre aux questions que les chercheurs ont sur l’utilisation du modèle.Le modèle Fibril préformé Alpha-Synuclein récapitule les caractéristiques clés de la maladie de Parkinson, telles que la pathologie alpha-synucléine et la neurodégénérescence. Et il a été démontré qu’il conduit à des déficiences motrices modestes dans certains modèles animaux. La formation d’inclusions contenant de l’alpha-synucléine phosphorylatée et un cours prolongé vers la neurodégénérescence offre aux chercheurs différentes étapes tout au long de la progression de la synucléinopathie, pour étudier et cibler des interventions thérapeutiques potentielles.Démontrant la préparation d’aiguilles en verre personnalisées, est notre technicien de laboratoire, Christopher Kemp. Pour commencer cette procédure, décongeler les monomères alpha-synucléine sur la glace. Re-suspened les monomères décongelés en feuilletant doucement sur le tube.Et centrifugeuse à 15 000 g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de micro centrifugeuse propre de 1,5 mL et enregistrez la quantité transférée. Diluer les monomères avec 1x dPBS à une concentration finale de 5 mg par mL.Brièvement vortex à mélanger, et brièvement centrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Ensuite, utilisez un film adhésif pour fixer le couvercle du tube de micro centrifugeuse fermé. Placez le tube dans un thermo-mélangeur orbital avec un couvercle pendant sept jours à 37 degrés Celsius tout en secouant à 1000 rpm.Au bout de sept jours, le contenu du tube doit apparaître trouble. Tout d’abord, en revuis tout l’équipement de protection individuelle nécessaire, y compris des gants, un manteau de laboratoire et un écran facial. Puis, dans un capot de culture cellulaire, fixez une sonde de 3,2 mm de diamètre au convertisseur.Réglez l’amplitude des sonicateurs à 30% et pulsez à une seconde sur et une seconde hors tension et le temps à une minute. Décongeler les fibrilles à température ambiante, et tout en restant dans le capot de la culture, diluer les fibrilles avec dPBS stérile. Ensuite, humidifiez un tissu de laboratoire avec 70% d’éthanol et utilisez-le pour essuyer la sonde du sonicateur pour le nettoyer.Submergez la pointe de la sonde dans de l’eau doublement distillée et pulsez 10 fois pour nettoyer davantage la sonde. Après cela, essuyez la sonde à sec avec un tissu de laboratoire. Placez la pointe de sonde nettoyée dans le tube de fibrilles diluées et placez la pointe au fond du tube.Sonicate les fibrilles diluées en utilisant les paramètres précédemment définis tout en déplaçant la sonde de haut en bas au cours de chaque impulsion pour s’assurer que tous les fibrilles dans le liquide sont sonicated. Après la sonication, centrifugeuse brièvement pendant une seconde à 2000 g pour recueillir tout le liquide des côtés du tube. Submergez la pointe de la sonde en 1% SDS et pulsez 10 fois pour nettoyer la sonde.Ensuite, retirez la pointe du SDS et submergez-la dans de l’eau distillée double et pulsez 10 fois. Essuyez la sonde avec un tissu de laboratoire amorti avec 70% d’éthanol et essuyez-la à sec avec un tissu de laboratoire sec. Détachez la sonde du convertisseur et rangez-la.Après cela, essuyez toutes les surfaces du capot avec 1% de SDS suivi de 70% d’éthanol. Pour commencer, placez un tube capillaire en verre siliconisé dans un tire-aiguille en verre. Allumez l’élément chauffant et laissez les poids attachés étirer le tube capillaire en verre chauffé.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper le tube capillaire en verre tiré au point le plus mince au milieu et retirer l’aiguille en verre du tire-aiguille en verre. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper une longueur de tube d’enveloppement de rétrécissement à environ 40 mm. Faites glisser l’enveloppe de rétrécissement sur l’aiguille métallique d’une seringue biseauté de 10 microlitres.Utilisez une flamme nue pour chauffer et coller l’enveloppe de rétrécissement à l’aiguille, tout en s’assurant de faire pivoter l’aiguille pour appliquer la chaleur uniformément. Faites glisser soigneusement l’extrémité plus grande de l’aiguille en verre tiré sur l’aiguille métallique de la seringue. Après cela, couper une longueur de tube d’enveloppement rétréci à environ 40 mm et le glisser soigneusement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille métallique de la seringue.Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe de rétrécissement pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal. Pour fixer davantage l’aiguille et prévenir les fuites potentielles, coupez une longueur supplémentaire de tube d’enveloppement rétréci à environ 40 mm et glissez-la soigneusement sur l’aiguille en verre pour chevaucher la base de l’aiguille en verre et l’aiguille métallique de la seringue. Utilisez une flamme nue pour chauffer l’enveloppe de rétrécissement pour fixer l’aiguille en verre à l’aiguille en métal.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper l’aiguille en verre de sorte que la pointe est d’environ 8 mm de long. Pour tester l’aiguille, remplissez une seringue de 1 mL d’une aiguille de calibre 26 attachée avec de l’eau distillée. Retirez le piston métallique de la seringue en verre personnalisée et insérez l’aiguille de la seringue remplie d’eau dans la base de la seringue personnalisée.Inspecter l’interface de l’aiguille en verre et de l’aiguille métallique pour décexer les fuites et confirmer un écoulement régulier de l’eau. Ensuite, remplissez un tube de micro centrifugeuse d’eau distillée. Utilisez la seringue d’aiguille en verre personnalisée pour puiser dans l’eau distillée.Inspectez l’aiguille pour confirmer que du liquide est pris dans la seringue et qu’il n’y a pas de bulles. S’il y a des bulles, ou si l’eau n’est pas aspirée dans l’aiguille, couper l’aiguille peut aider à alléger la pression. Après cela, conservez soigneusement la seringue avec les aiguilles de verre attachées, dans les boîtes de seringue jusqu’à ce que nécessaire pour les chirurgies.L’examen par microscopie électronique de transmission confirme la présence de longs fibrilles. En comparaison, les monomères alpha-synucléine sont visibles par l’orge et n’ont pas de forme discernable. La confirmation analoïde des fibrilles est alors confirmée à l’aide d’un essai de Thioflavin T.Un essai représentatif montre que le dPBS et les monomères de souris produisent un signal inférieur dans les unités flouresent relatives par rapport aux PFFs de souris. Le monomère humain d’alpha-synucléine produit un signal semblable au monomère de souris. Alors que les PFF humains produisent également un signal plus élevé que les monomères.Pour asses la présence de fibrilles pelitibles, un test de sédimentation est effectué. Dans les échantillons de souris et de PFF humains, l’infraction supernée devrait avoir plus de protéines dans la pastille que le supernatant. En revanche, la majorité de la protéine de la souris et des monomères humains est présente dans le supernatant avec peu de présent dans la pastille.Les PFF de souris et d’humains sont sonicated pour produire des PFFs des longueurs appropriées pour ensemencer des inclusions d’alpha synucléine. Un examen complet d’environ 500 fibrilles révèle que la longueur moyenne des fibrilles de souris est d’environ 44 nanomètres. Avec 86,6% des PFF mesurant 60 nanomètres ou moins.Les PFF humains, cependant, ont une longueur moyenne d’environ 55,9 nanomètres avec 69,6% des PFF mesurant 60 nanomètres ou moins. L’examen in vivo de l’efficacité de PFF est confirmé utilisant l’immunohistochimie. Les inclusions formées dans le nigra de substantia, partagent des propriétés semblables aux corps de Lewy en ce qu’elles contiennent la synucléine alpha phosphorylatée, contiennent des structures aminloyed, et tachent avec le thioflavine S, et sont résistantes à la digestion de Proteinase K.La sonication peut exposer la sonication individuelle aux fibrilles préformées aérosolisées. En tant que tel, des vêtements de sécurité appropriés doivent être portés et la sonication effectuée dans une hotte pour minimiser le risque d’exposition.

Research

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