Cette recherche a été soutenue par R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) et les fonds de démarrage UT Southwestern (JPM).

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le sud-ouest institutionnel Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux UT, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l&#39;inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire. 1. Chambre Dissection Une chambre de dissection personnalisé et petit, mince planche de plastique sont nécessaires pour obtenir les meilleurs résultats (figure 1). Construire ou obtenir une telle chambre avant de tenter ce protocole. 2. Solutions de dissection <ol><li> Préparer 1 litre de liquide céphalo-rachidien artificiel standard (aCSF) pour une utilisation dans les étapes 03.22 à 05.04. Ajouter NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 25 mM, NaH 2 PO 4 1,25 mM, myo-inositol 3 mM, pyruvate de sodium à 2 mM, l&#39;ascorbate de sodium 0,4 mM, et de glucose 25 mM à 1 L d&#39;eau apyrogène. </li><li> Préparer l&#39;aCSF de dissection initiale (200 ml) pourutiliser dans les étapes 3.3 à 3.22. Prenez 200 ml de la norme aCSF et augmenter la concentration de MgCl2 par 9 mM en ajoutant 0,366 g de MgCl 2 hexahydraté. </li><li> Préparer la solution de norme assortie d&#39;effectuer des stimuli au VNO par la canule pour une utilisation dans les étapes 4.11 à 5.4 contenant NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM. </li><li> La bulle de 0,8 L d&#39;aCSF standard et 0,5 L de Ringer avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux dans un bain d&#39;eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Bubble les 200 ml d&#39;aCSF de dissection initiale avec 95% O 2, 5% de CO 2 gazeux sur de la glace pendant 15 à 20 min jusqu&#39;à ce qu&#39;elle atteigne 4 ° C. </li></ol> 3. Dissection primaire <ol><li> Préparer la zone de dissection. Placez trois boîtes de 35 mm de Pétri, oxygéné aCSF, ciseaux de décapitation, courbes dissection, ciseaux de dissection droite ciseaux, pince Adson, un cuir chevelu # 11el lame et la poignée et une lame de rasoir sur de la glace. </li><li> Après oxygéné aCSF a refroidi à 4 ° C, anesthésier l&#39;animal profondément dans une chambre de dessiccation en utilisant 5.2 ml Isothesia (99,9% isofluorane). Effectuer des tests de pincement queue et pieds pour s&#39;assurer que l&#39;animal est sous anesthésie profonde. </li><li> Une fois l&#39;anesthésie profonde est confirmée, décapiter l&#39;animal et placer immédiatement la tête dans une boîte de Pétri remplie avec la dissection aCSF réfrigérés. REMARQUE: Plonger le tissu dans la dissection froide aCSF pour le garder frais tout au long de la procédure lorsqu&#39;il n&#39;est pas utilisé. </li><li> Retirer l&#39;aspect inférieure (ventrale du pharynx, de la mâchoire inférieure et la langue) avec des ciseaux courbes. </li><li> Utilisation Adson forceps deglove (zeste) la peau superficielle et insertions musculaires du crâne. Peler le cuir chevelu de caudal à rostral jusqu&#39;à ce que le seul site de fixation est sur les dents de devant. Couper le tissu au point de fixation à l&#39;aide des ciseaux courbes. Retirer les yeux en le saisissant avec une pince et retirez-le de la préparation. Nl&#39;oreille la fin de la procédure dégantage, éviter une force excessive sur le cartilage nasal délicate en utilisant les forceps Adson de libre insertions musculaires des os de la mâchoire supérieure. REMARQUE: Retirez le cuir chevelu de la partie caudale du crâne avec des ciseaux droits. </li><li> Avec les ciseaux droits, couper la ligne médiane du crâne de caudal à rostral jusqu&#39;à ce que les pointes du ciseau sont quelques mm dans les os frontaux (juste avant le sinus rhinal). </li><li> Retirez le pariétal et frontal du crâne avec une pince Adson. REMARQUE: Des morceaux de l&#39;os frontal ne restent souvent attachés aux os du nez caudale du sinus rhinal. Enlevez ces morceaux en prenant soin de ne pas contacter les bulbes olfactifs. </li><li> Utilisez le scalpel pour faire une coupe coronale par le lobe frontal 2 mm caudale pour les sinus, puis retirez la caudale du cerveau à la coupe. Assurer la pointe des contacts de scalpel le contour osseux du crâne ventrale de couper complètement le tissu postérieur. NOTE: Cela permetsuppression de la majorité du cerveau sans mettre le stress mécanique sur les voies olfactives latérales ou bulbes olfactifs. </li><li> Retirez les aspects exposés caudale du crâne ventrale avec des ciseaux droits. Laissez les sinus et le reste du tissu nerveux. </li><li> Retirer l&#39;arcade zygomatique et des muscles faciaux sur le côté droit anatomique du crâne à l&#39;aide des ciseaux droits </li><li> Tournez le museau plus (face ventrale) pour exposer le toit de la bouche. </li><li> Couper et enlever le palais immédiatement caudale pour les incisives. Pour ce faire, en insérant l&#39;extrémité de la lame de scalpel sous le palais parallèle sur le toit de la bouche, puis déplacer la lame vers les incisives. </li><li> Saisissez le (rostrale) libéré bord de la bouche avec une pince Adson et enlever en tirant caudale. </li><li> Sur le plan anatomique gauche du crâne, utiliser la lame de scalpel pour étendre les trou palatin caudale, à partir des petits trou près des molaires. Atteindre cet objectif en insérant l&#39;extrémité de la bla scalpeldé dans le vide près des molaires et en tournant le poignet. REMARQUE: Utilisez une extrême prudence pour utiliser uniquement la pointe de la lame - une coupure profonde peut endommager les tissus du septum. </li><li> Avec la pointe de la lame de scalpel, couper du foramen palatin par les incisives, à partir rostrale de l&#39;organe voméronasal gauche anatomique. Utilisez plusieurs coupes de notation. Ne pas endommager le tissu septal et les nerfs voméronasal en insérant la lame trop profonde. </li><li> Tourner le tissu de sorte que le crâne dorsale est orientée vers le haut et ensuite orienter la lame de rasoir à la verticale (parallèle à la ligne médiane) au bord extrême de la préparation. </li><li> Au niveau du bord ventral du tissu, toucher le bord de coupe de la lame de rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane. Balancer doucement la lame et se déplacer le long du trou palatin gauche (région introduit à l&#39;étape 3.14 couper). </li><li> A la partie dorsale du tissu, de placer le bord de coupe du rasoir immédiatement à la gauche de la ligne médiane (moins de 1 mm). </li><li> Tenuela lame parallèle à la ligne médiane, basculer la lame de rasoir avec la pression lentement vers la partie antérieure du tissu. Remarquez résistance à la lame criblée. Arrêtez immédiatement après le cassage par cette résistance. NOTE: A ce stade, l&#39;hémisphère droit est desserré de l&#39;hémisphère gauche. La connexion ne reste plus entre les hémisphères le long de la dorsale museau en avant de la lame criblée. </li><li> Séparez les hémisphères en les saisissant près des côtés caudale avec les doigts gantés et délicatement tourner latéralement et en avant. REMARQUE: Cette étape est une source de variabilité expérimentale, en particulier chez la souris à museau déviées ou fragiles (par exemple, les souris plus âgées). En outre, lors de la tentative de faire tourner les demi-sphères à une distance l&#39;une de l&#39;autre, si une forte résistance est rencontrée marquer le museau dorsale (antérieure à la lame criblée) pour affaiblir les tissus conjonctifs. Ce faisant, prendre une extrême prudence de ne pas insérer le scalpel profondément, ce qui peut endommager le ti septalessu et les nerfs voméronasal. </li><li> Appliquez une petite quantité (50-100 pi) de colle à tissu sur la planche et placez doucement le bord latéral de l&#39;hémisphère droit sur la colle en utilisant les forceps Adson. Retirer l&#39;excès d&#39;humidité de la face latérale de la préparation à l&#39;aide d&#39;une serviette en papier pour empêcher la polymérisation de la colle prématurée et l&#39;adhérence lâche à la planche. NOTE: appliquer quelques gouttes de la dissection aCSF refroidi sur de l&#39;échantillon afin d&#39;accélérer la polymérisation de la colle après que le tissu est placé sur la colle. Cela garantit que le tissu reste bien en attente à la planche. </li><li> Placer une petite quantité (d&#39;un diamètre de 5.3 mm, 2 mm de profondeur) de la graisse à vide dans le milieu de la chambre de dissection secondaire et placer le côté de la face de la planche en tissu fermement contre la graisse. Remplir immédiatement la chambre de dissection froide dissection aCSF, transférer dans la zone fin de dissection et de commencer la perfusion avec oxygénée aCSF standard. Orienter la lame de façon que le bulbe olfactif est directement dans l&#39;flux fraîchement oxygéné aCSF standard. </li></ol> 4. Dissection secondaire <ol><li> Retirez tout controlatérale (gauche) bulbe olfactif visible ou tissu cortical de la préparation à l&#39;aide de pinces fines. Pincez les pinces fines (formant une pointe émoussée semi), puis placez-le à la partie dorsale et caudale du tissu près de la ligne médiane. Doucement courir la pince pincé le long de la ligne médiane, le pelage du tissu loin de l&#39;hémisphère droit lentement en mouvement antérieur. Retirez tout le tissu controlatéral, y compris le tissu de bulbe olfactif controlatéral. Prenez soin de ne pas poignarder à travers le tissu, ce qui peut causer des dommages à l&#39;AOB ou voméronasal nerf. </li><li> Observer la dure-mère blanc le long de la surface dorsale / médial du bulbe olfactif. Déchirez cette dure-mère le long du bord dorsal / caudale du bulbe olfactif en saisissant à la partie la plus blanche de la dure-mère avec deux paires de pinces fines et tirez-les loin de là. La durée est étroitementenroulé autour des bulbes olfactifs, et peut facilement se couper à travers le tissu pendant qu&#39;il est retiré. Éviter d&#39;endommager la surface interne du bulbe olfactif et l&#39;AOB lui-même. NOTE: Si la durée résiste déchirer facilement à ce stade, d&#39;introduire une petite coupe avec des ciseaux fins de dissection de pointe de printemps pour faciliter la séparation. </li><li> Lentement et soigneusement décoller le cortex frontal avec des pinces fines sans endommager les bulbes olfactifs sous-jacents. Observer une collection de vaisseaux sanguins apparaissent comme un filet semi-transparent immédiatement caudale à l&#39;AOB. Retirer ce filet avec des pinces fines pour faciliter la pénétration de l&#39;électrode dans des expériences électrophysiologiques. Saisir le filet avec des pinces comme le sépare de la AOB lors de la rentrée de cortex frontal et l&#39;enlever en tirant en bas et en dedans, en faisant attention de ne pas toucher l&#39;AOB. Une fois que le cortex frontal a été séparé des bulbes olfactifs, retirez-en le coupant avec une pince ventrale et postérieure à l&#39;AOB. REMARQUE: Prenez extreme soins à l&#39;enlèvement net, car si cela est fait trop rudement la couche glomérulaire peut être endommagé. </li><li> Dans la cavité nasale controlatérale exposée, enlever tout tissu septal controlatéral restant (feuille fragile jaunâtre contenant des vaisseaux sanguins) en utilisant les pince fine. Saisissez le tissu à la région caudale / dorsale (près de l&#39;os de la cloison) et puis tirez / soulever le tissu vers le côté antérieur. NOTE: Le tissu septal controlatéral peut être retiré par inadvertance pendant l&#39;étape d&#39;hémisection (étape 3.20). Dans ce cas, respecter un blanc, cartilage septal avasculaire et le légèrement transparent, vascularisé septale os. Si tel est le cas, l&#39;étape 4.4 peut être ignorée. </li><li> Retirez délicatement le VNO controlatéral par l&#39;exécution d&#39;un point de la pince fine entre le cartilage septal et la &quot;aile&quot; VNO (un mince morceau de tissu osseux qui longe le bord dorsal de deux VNO unique. <ol><li> Après le détachement de l&#39;aile du cartilage, déplacer la pointe de la pince sur le ventredans le VNO controlatéral près de la ligne médiane. Répétez cette étape à plusieurs endroits le long de l&#39;axe caudale / rostrale du VNO controlatéral pour le desserrer, ce qui lui permet d&#39;être éliminé en saisissant avec une pince et se soulever. </li></ol></li><li> Préparez-vous à retirer le cartilage septal en faisant une coupe au bord ventral / caudal (où il se rétrécit à un blanc avasculaire bande de fonctionnement du côté ventral de l&#39;os de la cloison) avec des pinces fines. </li><li> Retirer le cartilage septal par pinçant les pince fine pour faire un point émoussé semi. Identifier la coupe faite à l&#39;étape 4.6, insérer la pince pincé derrière (latérale) à cette coupe, puis soulevez lentement le cartilage loin du tissu septale et de procéder rostralement. NOTE: Ne pas perturber le tissu septal sous-jacent. Comme le cartilage est levé, observer la feuille sous-jacente de l&#39;étirement des tissus septale due à des adhérences lâches au cartilage. Un mouvement périodique, doux et stable des pinces fines pincés sur ce site d&#39;un lâchedhesion peut grandement faciliter la séparation réussie des deux structures. </li><li> Utilisez une paire de pinces # 3 avec une pointe recourbée pour enlever l&#39;os de la cloison. Approcher l&#39;os du septum à un angle à peu près parallèle au plan de l&#39;os septal. Insérer la dent incurvée entre le tissu septal et septale os. Saisissez l&#39;os avec la pince et déplacez doucement l&#39;os en arrière jusqu&#39;à ce qu&#39;il fissures près de la lame criblée. REMARQUE: Dans certains cas, l&#39;os septal résiste casser près de la lame criblée. Dans ce cas, utilisez une pince fine à marquer doucement l&#39;os de la cloison le long de l&#39;axe de dorsale / ventrale juste en avant de la lame criblée, puis répétez l&#39;étape 4.8. </li><li> Retirer le cartilage blanc juste rostrale au VNO par pincement avec une paire de pinces fines à l&#39;entrée et en tirant rostralement avec une autre paire de pinces fines. </li><li> Fixez la canule de polyimide à un dispositif de perfusion rapide et démarrer le flux de la solution de Ringer (0,1-0,3 ml / min) à travers la canule de polyimide.Débit Mesure avec un débitmètre petit volume en ligne: NOTE. Utilisation d&#39;un dispositif de commutation pneumatique de relance piloté par ordinateur réduit les changements de débit pendant la stimulation. Comparer les réponses de neurones pour tester stimuli avec des réponses à un stimulus maquette (contrôler la solution de Ringer) pour assurer des réponses sont spécifiques stimulus. </li><li> Orienter la canule parallèle à l&#39;entrée VNO. Lorsque la canule est satisfaisante parallèle à l&#39;entrée VNO, montre que la pression de sortie provoque le VNO à &quot;gonfler&quot;, conduisant à l&#39;évacuation du vaisseau sanguin. Insérer immédiatement la canule dans le VNO, en gardant l&#39;angle de la constante de canule de sorte qu&#39;il demeure parallèle à l&#39;ouverture VNO. REMARQUE: Il peut être utile de tenir la canule avec une paire de pinces fines contre la planche de plastique et utiliser une autre paire de pinces fines à l&#39;angle de la fin de la canule légèrement vers le haut. Si l&#39;on place par inadvertance la canule derrière le VNO, la sortie peut également provoquer le vaisseau sanguin VNOà évacuer, ce qui conduit à l&#39;impression d&#39;une canule appropriée a été effectuée. Emplacement correct peut être confirmée par l&#39;incorporation d&#39;un colorant dans une solution de Ringer. Lorsque la canule est correctement placé, le colorant doit seule sortie par l&#39;entrée VNO. En outre, on peut confirmer le positionnement correct en faisant en sorte que la canule est facilement visible à travers la face interne semi-transparent du VNO. </li><li> Déplacer la planche de plastique lentement jusqu&#39;à ce que la AOB est dans le flux direct de la aCSF standard, en prenant soin de ne pas déloger la canule du VNO. La dissection est terminée et l&#39;évaluation de la fonction physiologique peut commencer immédiatement. Étape 5 décrit brièvement une approche pour faire une telle évaluation. </li></ol> 5. Evaluation <ol><li> Pénétrer la surface de la AOB 2-4 MQ avec une microélectrode de verre de borosilicate attaché à un amplificateur extracellulaire et oscilloscope. </li><li> Avancer lentement la microélectrode à une profondeur de 100-200 um de lasurface à un débit de 50 pm / min. NOTE: A cette profondeur de tissu, on rencontrera l&#39;action spontanée des signaux potentiels occasionnels, illustrés par de brèves (~ 1-2 msec) déviations brusques de la tension de microélectrodes. </li><li> En rencontrant une action onde potentiel, cesser d&#39;avancer la microélectrode. </li><li> Observer et / ou enregistrer le taux potentiel d&#39;action tout en changeant la solution de livraison de relance de contrôle Ringer à un activateur connu de l&#39;activité de VSN (par exemple, la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Si la dissection a été un succès, un changement de stimulus-dépendante dans l&#39;action taux potentiel ou potentiel de champ local peut être observée. REMARQUE: tous les neurones AOB répondront à tous les stimulus avec une augmentation de la fréquence de mise à feu (y compris la solution de Ringer contenant 50 mM de KCl). Une diminution de stimulus-dépendante du taux de tir indique également la connectivité fonctionnelle et une dissection de succès. Dans le cas où deux ou plus de neurones que l&#39;on rencontresont insensibles à VNO stimulation, ou si aucun des potentiels d&#39;action sont observés après de multiples pénétrations d&#39;électrodes, ce qui suggère une dissection sans succès. Si tel est le cas, une nouvelle dissection peut être initiée à l&#39;étape 3. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont aucun d&#39;importants conflits d&#39;intérêt à divulguer.

L&#39;ex préparation VNO-AOB vivo décrite dans ce protocole est une alternative intéressante à anesthésiés in vivo 5-7 et tranche en direct aiguë 17 expériences de la fonction AOB. Contrairement aigus expériences AOB de tranche, qui exposent également des éléments de circuit pour des enregistrements électrophysiologiques et optiques, cette préparation conserve tous les afférences sensorielles et les connexions intra-AOB. Bien que cela peut aussi être dit d...

Traitement sensoriel dans le cerveau des mammifères couvre généralement plusieurs circuits neuronaux réciproquement connectés, chacun extrait les caractéristiques particulières de l&#39;entrée sensorielle. Dans les voies sensorielles, début traitement de l&#39;information est essentielle à la perception et le comportement normal. Dans le système olfactif accessoire (AOS), le bulbe olfactif accessoire (AOB) est le principal circuit neuronal qui relie la périphérie sensorielle aux structures en aval qui dictent l&#39;équilibre hormonal 1,2, 3 agression, et l&#39;excitation 4. En tant que tel, le traitement de l&#39;information au sein de ce circuit est fortement liée à l&#39;évolution du comportement animal. Le bulbe olfactif accessoire se trouve chez les souris et les rats à l&#39;aspect dorsal / caudale / postérieure du bulbe olfactif principal (MOB) sous la dense, vascularisé sinus rhinal. L&#39;AOB reçoit innervation afférente de axones des neurones sensoriels voméronasal périphérique (VSN) qui résident dans l&#39;organe voméronasal (VNO), un small tube borgne dans le museau antérieure juste au-dessus du voile du palais. Ces axones traversent la feuille sensible de tissu septal à la limite médiale de passages nasaux. Plusieurs études ont sondé les réponses neuronales AOB à des sources d&#39;odeurs AOS (tels que l&#39;urine de la souris) in vivo utilisant des souris anesthésiées 5-7 ou animaux librement explorer 8. L&#39;héroïque anesthésiés dans les études in vivo concernés (a) trachéotomie pour assurer une anesthésie profonde et prévenir l&#39;aspiration des stimuli 5-7 liquide, (b) la stimulation du ganglion sympathique cervical 6 ou canulation directe de l&#39;organe voméronasal 5,7 à introduire les odeurs non volatiles et (c) avec ou sans craniotomies ablations du lobe frontal pour permettre l&#39;avancement dans l&#39;électrode AOB 6. Awake / se comporter études 8-10 implantation chirurgicale impliqués d&#39;une microdrive. En somme, ces paradigmes expérimentaux sont puissants, mais extrêmement difficile et nécessitent une anesthésie souvent. (ex vivo) avec un certain succès 11-15. Parce que les liens entre le VNO et AOB restent ipsilatéral, et parce que le tissu médiane septale peut être exposé à superfusat oxygéné dans un seul hémisphère, nous avons cherché à développer une telle approche ex unique de l&#39;hémisphère vivo d&#39;isoler ces structures tout en maintenant leur connectivité fonctionnelle. Nous avons récemment réussi à atteindre cet objectif 16. Cette préparation conserve à la fois le VNO et AOB vivant et relié fonctionnellement au moins 4 - 6 h parce que les deux axones (le long de la ligne médiane tissu septal doux) et AOB sont relativement peu profonds &lt;600 um fonctionnalités qui sont accessibles à superfusées liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné ( aCSF). Cette ex préparation VNO-AOB vivo permet l&#39;introduction de stimuli contrôlés dans le VNO par une canule mince, etun accès visuel direct à la petite AOB pour le placement des électrodes ciblée et / ou microscopie à fluorescence en direct. Ce procédé est avantageux si l&#39;on souhaite étudier ces circuits, en l&#39;absence d&#39;anesthésiques. Parce que cette approche rompt les connexions centrifuges, il n&#39;est pas bien adapté aux demandes de renseignements dans la modulation de la fonction centrifuge AOB. L&#39;ex préparation VNO-AOB vivo est difficile à apprendre, mais une fois atteint produit une plate-forme fiable sur laquelle enquêter sur l&#39;organisation du circuit, le traitement de l&#39;information, et la plasticité neuronale dans ce circuit sensoriel puissant.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Straight Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-Curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11006-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#3 Scalpel Handle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#11 Scalpel Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Chamber</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>See Fig. 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td>
			<td>Custom&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>146355D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Biologie Tip</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps, Student</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.0045&#34; Polyimide Tubing</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>823400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-45505-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-171-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two ton epoxy</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>5E157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>09-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ValveLink digital/manual controller</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>01-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

Le système olfactif accessoire de la souris (AOS) est une voie sensorielle spécialisé pour détecter les odeurs non volatiles sociaux, les phéromones, et kairomones. Le premier circuit de neurones dans la voie AOS, appelé le bulbe olfactif accessoire (AOB), joue un rôle important dans l&#39;adoption de comportements sexuels typiques tels que l&#39;agression territoriale et l&#39;accouplement. Ce petit (&lt;1 mm 3) circuit possède la capacité de distinguer des états comportementaux uniques, tels que le sexe, la souche et le stress à partir d&#39;indices chimiosensoriels dans les sécrétions et des excrétions de leurs congénères. Bien que l&#39;organisation de ce système compact offre des possibilités uniques pour l&#39;enregistrement de grandes portions du circuit simultanément, l&#39;enquête du traitement sensoriel dans le AOB reste difficile, principalement en raison de son emplacement expérimentalement désavantageuse dans le cerveau. Ici, nous démontrons une dissection multi-étape qui élimine l&#39;AOB intacte à l&#39;intérieur d&#39;un seul hémisphère du crâne de souris antérieure, laissant connecterions à la fois les voméronasal périphérique neurones sensoriels (VSN) et circuits neuronaux locale intactes. La procédure expose la surface de AOB pour diriger l&#39;inspection visuelle, ce qui facilite les enregistrements électrophysiologiques et optiques à partir des éléments de circuit AOB en l&#39;absence d&#39;anesthésiques. Lors de l&#39;insertion d&#39;une canule fine dans l&#39;organe voméronasal (VNO), qui abrite les VSN, on peut exposer directement la périphérie des odeurs et des phéromones sociaux tout en enregistrant l&#39;activité en aval dans la AOB. Cette procédure permet enquêtes contrôlées dans AOS traitement de l&#39;information, qui peuvent faire la lumière sur les mécanismes reliant l&#39;exposition à la phéromone à des changements de comportement.

Atteindre le succès avec cette préparation prend beaucoup de pratique, et a plusieurs étapes à laquelle il peut échouer. On devrait s&#39;attendre à exiger de nombreuses tentatives avant de parvenir à la réussite. La chambre de dissection personnalisé est nécessaire pour la réussite de ce protocole, et doit être obtenue avant de commencer les étapes ultérieures de la dissection. La conception de la chambre présentée sur la figure 1 est suffisante à cette fin, et peut être réalisé en ...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

L&#39;ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l&#39;information des phéromones de souris et kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K vues.  UT Southwestern Medical Center.  L'ampoule accessoire olfactif de la souris (AOB) a été difficile à étudier dans le contexte du codage sensoriel. Ici, nous démontrons une dissection qui produit in vivo préparation ex dans laquelle les neurones AOB restent fonctionnellement connectées à leurs entrées périphériques, ce qui facilite la recherche en traitement de l'information des phéromones de souris et kairomones. 

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Enregistrements tableau multiélectrodes de l&#39;épithélium Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Recherche

Neurosciences

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Imagerie des cellules vivantes des cellules sensorielles de précurseurs d&#39;organes en Intact Drosophile Les chrysalides

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

Cibler les neurones Bulbe olfactif Utiliser combiné In Vivo L&#39;électroporation et de Gal4-Based Enhancer Piège Lignes Zebrafish

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

Activités d&#39;imagerie Odeur évoqués dans le bulbe olfactif de la souris en utilisant la réflectance optique et Signaux Autofluorescence

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Réponses d&#39;imagerie neuronale dans les préparations d&#39;organe voméronasal Slice Exprimant un capteur de calcium codées génétiquement

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

Enregistrement Neuronal activité induite de Température-travers le contrôle des modifications de calcium dans le bulbe olfactif de<em&gt; Xenopus laevis</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

En profondeur Physiological Analyse des populations de cellules définies dans le tissu Tranches aiguë de l&#39;Vomeronasal Organ Souris

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...