Les auteurs remercient Tracy Young-Pearse et Atsushi Kamiya pour fournir des plasmides. Ce travail a été financé par NEURON-ERA-NET DISCover à OU et CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1; GRK1033) de CK, et (DE 792/2-4) MASS

Toutes les expériences animales ont été autorisées par le responsable Landesministerium für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV NRW; 87-51.05.2010.A301) en conformité avec la législation européenne et nationale. 1. Électroporation in utero Cette méthode a été décrite en détail dans JoVE pour le rat par Walantus et al. 3, ainsi que Rice et al. 4 et est ici résumée brièvement. Une taille de la portée de chiots 6-8 donne un bon résultat. Il devrait y avoir au moins deux embryons non électroporation afin d&#39;augmenter le taux de survie globale (voir ci-dessous). <ol><li> Préparer l&#39;ADN Mélange qui contient 1,5 ug / ul de plasmide cible (shRNA: pENTR-U6, Invitrogen, Eugene, OR / DISC1 surexpression: pCAX 21), 0,5 pg / pl luciférase contenant le plasmide (pCAX), 0,5 pg / pl GFP contenant le plasmide (pCAGGS 22) 1x PBS solution souillé blu lumièree avec Fast Green Dye. </li><li> Préparer des aiguilles d&#39;injection de tubes capillaires en verre avec une pipette à aiguille extracteur. Et stériliser les instruments chirurgicaux, soit par autoclavage ou incubation avec un désinfectant à base d&#39;alcool (kodan Tinktur forte). </li><li> Administrer une dose pré-opératoire de la buprénorphine (0,05 mg / kg) 15 minutes avant l&#39;intervention chirurgicale pour un rat enceinte 16 jours après la fécondation (E16). Puis anesthésier l&#39;animal dans une chambre de l&#39;isoflurane. <ol><li> Après l&#39;anesthésie, de placer le rat en décubitus dorsal sur une table d&#39;opération 37 ° C-chauffé avec le masque de respiration relié au dispositif d&#39;anesthésie, en utilisant de l&#39;oxygène au réglage de 0,4 L / min et de l&#39;isoflurane à 1,8%. </li><li> Après le rasage de l&#39;abdomen, désinfecter la zone rasée trois fois avec kodan Tinktur Forte (un désinfectant à base d&#39;alcool). </li><li> Couvrir le rat avec des tissus stériles, exposant que le champ d&#39;opération rasée. </li></ol></li><li> Effectuer électroporation in utero. <ol><li> Couper l&#39;abdomen avec un scissor le long de la ligne blanche (~ 2 cm). </li><li> Exposer les cornes utérines soigneusement avec un anneau pince. </li><li> Prenez soin de garder la paroi de l&#39;utérus humide avec réchauffé PBS stérile pendant toute la chirurgie. </li><li> Injecter la solution d&#39;ADN avec une aiguille de verre mince dans l&#39;un des ventricule latéral des embryons. </li><li> Placer l&#39;électrode 7 mm autour de la tête de l&#39;embryon. Pour atteindre une population de cellules de couches corticales supérieures, effectuer la IUE à E16 23 et positionner l&#39;électrode positive sur l&#39;hémisphère au-dessus du ventricule injecté avec une légère tendance dorsale / latérale. Pour cibler les cellules de l&#39;hippocampe changer le placement de l&#39;électrode positive vers le côté opposé à celui du ventricule latéral injecté avec ou légèrement en direction dorsale (Figure 1). </li><li> Effectuer électroporation par cinq 50 impulsions ms à 55 V avec 950 sauts msec avec une onde carrée impulsion électroporateur. </li><li> Épargner le premier embryon à la fin vaginale de chaque corne de l&#39;utérus afin d&#39;augmenter til les chances de survie de tous les embryons. </li><li> Mettez les cornes de l&#39;utérus de nouveau dans la mère rat. </li><li> Stich la paroi abdominale avec un matériau de suture chirurgicale résorbable Vicryl. </li><li> Fermer la peau avec le matériau de suture Vicryl ou avec des agrafes de suture. </li><li> Placez la mère rat dans la cage de la maison et le garder au chaud pendant 2-3 heures. </li><li> Tenez les seuls rats dans leur cage à domicile dans la salle de l&#39;animalerie et nourrir ad libitum. Ils donnent naissance entre E22-24. </li><li> Gardez les ratons avec leur mère pendant trois semaines et de les séparer ensuite par sexe. </li></ol></li></ol> 2. Bioluminescence imagerie en direct de la réaction enzymatique de la luciférase Cette méthode est utilisée pour analyser la position des cellules transfectées in utero. Co-électroporation ADNc luciférase de luciole est traduit en luciférase active, qui, lors de la métabolisation D-luciférine à oxyluciférine, émet un photon (figure 2 </strong&gt;). La luminescence qui en résulte peut être détectée dans les cerveaux de jeunes rats électroporées positifs dans un spectre IVIS jusqu&#39;à l&#39;âge d&#39;environ 35 jours après la naissance (figure 4). Dans la présente étude, le dosage de la luciférase et la bioluminescence imagerie a été réalisée à partir de P7. Ce point de temps a été choisie pour permettre la mère et les chiots de récupérer du stress de la naissance. Lorsque l&#39;on travaille d&#39;abord avec les petits à P0, la survie des petits a été durement touchée en ce que les chiots ont été retrouvés morts ou mangés par la mère. Initialement, les ratons avec électroporation succès sont identifiés par une image 2D-bioluminescence avec un temps d&#39;exposition de trois minutes. Par la suite, les chiots positifs sont utilisés pour créer des images 3D afin de préciser la localisation de la zone électroporation. <ol><li> Diluer le sel de sodium de D-luciférine dans du PBS à une concentration de 15 mg / ml et le stériliser par filtration à travers un filtre à seringue stérile. </li><li> Peser les chiots. </li><li> Prenez le chiot dans une main avec l&#39;abdomen sur le dessus et se détendre légèrement l&#39;abdomen. Injecter 10 ul / g de poids corporel d&#39;une solution de luciférine intrapéritonéale. Pour les plus grands et plus agiles, pré-anesthésier les chiots avec l&#39;isoflurane dans la chambre d&#39;induction avant d&#39;injecter le luciférine. </li><li> Allumez l&#39;afflux isoflurane du système de gaz d&#39;anesthésie XGI-8 dans le spectre IVIS avec 3% d&#39;isoflurane. </li><li> Mettez le museau de l&#39;animal dans les cônes de nez de verre du système d&#39;anesthésie. </li><li> Maintenir l&#39;animal dans une position couchée jusqu&#39;à ce qu&#39;il se trouve dans une anesthésie profonde (2-3 min). Puis réduire l&#39;afflux isoflurane à 1,5%. </li><li> Choisissez une mesure 2D-bioluminescence pour sélectionner chiots positives de toute la portée. Utilisez les paramètres suivants <img alt="Écran 1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <ol><li> Définir un CHECkmark sur la photographie à binning moyen et F / Stop à 8, l&#39;appareil prend une photo d&#39;en haut après le début de la mesure. </li><li> Filtre d&#39;excitation Set: bloc. </li><li> Régler filtre d&#39;émission: ouvert. </li><li> Réglez Binning à moyen. </li><li> Réglez F / Stop à 1. </li><li> Réglez le niveau de l&#39;étape A. </li><li> Réglez la luminescence du temps d&#39;exposition à 180 sec. </li></ol></li><li> Pour la création d&#39;images 3D afin de mieux quantifier la zone électroporation des chiots positifs, utiliser les paramètres suivants DLIT pour la luciférase de luciole. <img alt="Écran 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <ol><li> Définir une coche sur la photographie, la caméra prend une photo d&#39;en haut après le début de la mesure. </li><li> Définir une coche sur la structure, la surface de l&#39;animal est scanné par le SIIV avant la mesure de la bioluminescence. </li><li> Usoi suivante filtres d&#39;émission et les paramètres de temps d&#39;exposition jusqu&#39;à l&#39;âge de deux semaines: filtre d&#39;émission 1: 590 nm, temps d&#39;exposition de 300 s filtre d&#39;émission 2: 600 nm, temps d&#39;exposition de 240 s filtre d&#39;émission 3: 620 nm, temps d&#39;exposition de 180 s filtre d&#39;émission 4: 640 nm, temps d&#39;exposition de 120 s Pour les rats âgés de plus de P20 filtre d&#39;émission 1: 600 nm, temps d&#39;exposition de 300 s filtre d&#39;émission 2: 620 nm, temps d&#39;exposition de 300 s filtre d&#39;émission 3: 640 nm, temps d&#39;exposition de 300 s <img alt="Écran 3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . En raison de la diminution de la puissance du signal dans les animaux plus âgés, le temps d&#39;exposition est agrandie pour les trois meilleurs filtres d&#39;émission. </li><li> Réglez le niveau de l&#39;étape B </li><li> Réglez Binning à moyen. </li><li> Réglez F / Stop à 1 </li></ol></li><li> Après la mesure, mar<html> k les rats par un code earhole de les différencier les uns des autres et de les faire correspondre aux images SIIV direct imagerie </li><li> A la fin de la procédure de mesure, éteignez l&#39;isoflurane afflux et maintenir le rat sur la plaque chauffée pendant quelques minutes avant de le remettre dans sa cage. </li></ol> 3. Analyse de bioluminescence Images La génération d&#39;images en 3D, des films en 3D et la quantification du volume de la source de signaux est effectué par le logiciel Living de l&#39;image pré-installé sur la IVIS spectre. <ol><li> Génération d&#39;images 3D <ol><li> Tout d&#39;abord, reconstruire une topographie de surface, donc régler le seuil entre 20-30%. <img alt="Écran 4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Écran 5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> een 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li> Lancer DLIT reconstruction 3D avec un seuil d&#39;image de 10% pour chaque longueur d&#39;onde. <img alt="Écran 7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Écran 8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Écran 9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . </li><li> Créez des films 3D en utilisant le bouton animé dans la barre d&#39;outils 3D. </li><li> Choisissez des orientations différentes de l&#39;image 3D, ainsi que des vues de zoom que des cadres clés et appuyez sur &#39;Enregistrer &amp; #39; bouton, enregistrer le passage d&#39;une position / orientation à l&#39;autre. <img alt="Écran 10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . </li></ol></li></ol> 4. Essai de comportement Tests de comportement a été réalisée afin de déterminer si des manipulations génétiques IUE médiation chez le rat peuvent initier effets à long terme qui persistent à l&#39;âge adulte. Dans le présent cas particulier, l&#39;effet de transitoire, unilatérale longueur DISC1 humaine corticale surexpression après IUE a été étudiée en testant locomotion dans un champ ouvert (DE), avec ou sans une faible dose d&#39;amphétamine, comme un test spécifique pour liés à la dopamine comportement 24. Dans une procédure similaire effectuée par Niwa et al. Chez la souris en utilisant IUE DISC1 effet de choc, les souris IUE mais pas les contrôles ont montré une hypersensibilitéà l&#39;amphétamine 18. Les rats qui ont été in utero électroporation avec un vecteur surexprimant DISC1 ont eu lieu dans des conditions de laboratoire avec 12 h de lumière 7 heures-19 heures et ont été nourris ad libitum. A 3 mois, les rats ont subi des tests de comportement. Pour la quantification de locomotion comme une visualisation des effets de l&#39;amphétamine, un champ ouvert d&#39;un système d&#39;activité Tru balayage situé dans une chambre de sons et de lumière isolé a été utilisé. Ce système mesure le temps de la durée et la distance les mouvements d&#39;animaux, le temps et la distance passées dans la marge ou au centre du champ, ainsi que l&#39;élevage comportement 25. <ol><li> Le premier jour, l&#39;essai après l&#39;injection de solution saline <ol><li> Peser les animaux. </li><li> Injecter par voie intrapéritonéale 1 ul / g de poids corporel d&#39;une solution saline (PBS 1x). </li><li> Juste après l&#39;injection, mettre l&#39;animal dans le champ ouvert et lancer la mesure du système TruScan. Record de 15 min und segmenter les données en 3 x 5 pièces min. </li><li> Placez le dos de l&#39;animal dans sa cage. </li></ol></li><li> Deuxième jour, essai sur l&#39;injection d&#39;amphétamine <ol><li> Peser les animaux. </li><li> Injecter par voie intrapéritonéale 1 ul / g de poids corporel d&#39;un / ml de solution de 0,5 mg d&#39;amphétamine. </li><li> Juste après l&#39;injection mettre l&#39;animal dans le champ ouvert et commencer la mesure du système TruScan. Le registre pendant 15 min et subdiviser les données en trois parties de 5 x min. </li><li> Retour à l&#39;animal de sa cage. </li></ol></li><li> Analyser la locomotion et le comportement élevage généré par un logiciel spécifique Tru Scan. Créer graphiques avec GraphPad (Prism) et calculer les statistiques par le logiciel SPSS Statistics. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

Les auteurs de cette étude n&#39;ont pas intérêt financier dans cette étude et n&#39;ont pas été parrainés par l&#39;industrie pour cette étude. Les frais d&#39;accès ouvert ont été apportées par la publication de poste PerkinElmer, Inc..

Notre étude montre que IUE est adapté pour générer des rats adultes avec des neurones exprimant un transgène dans une zone désignée du cerveau et qui, à la suite de cette intervention, ces animaux présentent des changements de comportement indiquant la fonctionnalité de la manipulation effectuée. Dans cette étude, par exemple, le rat surexprimant DISC1 unilatéralement dans une petite partie du cortex préfrontal ont montré une hypersensibilité à l&#39;amphétamine (figure 9). Sélection des rats pour la réussite d&#39;électroporation in vivo par imagerie par bioluminescence a été efficace dans le contrôle de la variabilité inhérente de la transfection de cellules IUE et a été appliquée pour générer des groupes avec une zone IUE homogène de faible variabilité inter-sujet pour les enquêtes ultérieures. Dans cette étude, nous n&#39;avons pas pu sélectionner chiots électroporation de la litière par détection de la fluorescence induite par GFP-co-électroporation chez l&#39;animal nouveau-né, même quandugh en même temps et dans le même animal d&#39;un signal de bioluminescence de la luciférase également co-électroporation n&#39;a pu être détectée après l&#39;injection luciférine (figure 6), et la GFP exprimant neurones étaient encore présents dans le cerveau à l&#39;âge de six mois. Nous en concluons que, chez le rat, la réaction luciférase / luciférine est bien adapté pour différencier les animaux avec des cerveaux électroporées avec succès (Figure 3). Le contrôle quantitatif de succès IUE se rapporte à la force du signal de bioluminescence qui est mesurée par les chiffres de photons à l&#39;intérieur de la même durée d&#39;exposition (figure 3) et correspond à l&#39;activité enzymatique de la luciférase co-exprimés. Petits signaux de bioluminescence sont détectables par 100-200 chiffres de photons, et, à un rayonnement de ~ 1x10 4 photons / sec / cm 2 / spectacle stéradian 1000-2000 cellules GFP-taché à l&#39;histologie dans le 6 mois cerveau de rat. Le disp signal le plus élevéétaient posées un éclat de jusqu&#39;à ~ 5x10 6 photons / sec / cm 2 / stéradian et ~ 64 000 chefs d&#39;accusation. Dans la souche de rat Sprague Dawley utilisé, nous avons observé un affaiblissement du signal de bioluminescence longitudinalement avec l&#39;âge et le signal a disparu au-delà de l&#39;âge de P35 (Figure 4). À ce stade, nous ne savons pas si l&#39;une ou l&#39;autre transitoire, expression à base de vecteur plasmide de luciférase diminue, ou si le signal de bioluminescence affaiblit raison de l&#39;augmentation massive du cerveau, ou les deux sont les causes pour le signal en voie de disparition. Pour le test fonctionnel présent dans les rats adultes, la sélection pour les études comportementales était simplement faite sur la base de l&#39;emplacement du signal, mais pas par bioluminescence la force du signal. Même si la surveillance de la bioluminescence quantitative 3D a permis la différenciation entre les différents domaines électroporation (figure 5), son exactitude a été limitée pour les cellules situées dans la dime de profondeurnsion du cerveau. figure 6 montre un exemple d&#39;une électroporation de l&#39;hippocampe où la mesure de la bioluminescence dans le 2D et le 3D image indique un bon positionnement de l&#39;électroporation. Dans le cerveau post-mortem disséqué, un signal GFP-fluorescence a été détecté à environ la même position que le signal de bioluminescence, ce qui indique un ciblage correct de l&#39;hippocampe. Mais histologie montre également que les cellules dans le cortex dorsal de l&#39;hippocampe ont été la cible (Figure 7). Ceci indique que le test de bioluminescence est un outil utile pour détecter, chiots IUE positifs et aussi d&#39;avoir une idée de la zone électroporation, mais, en fin de compte, l&#39;imagerie ne peut pas remplacer l&#39;autopsie histologie exactement localiser les cellules positivement ciblées. Notre démonstration indique promesse pour l&#39;application de la technologie IUE pour générer manipulations ciblées subtiles de régions corticales du cerveau ou de l&#39;hippocampe pour simuler aberrances en cmigration ortical ou autres défauts qui peuvent influer sur le développement neurologique de l&#39;animal adulte. Alors que l&#39;électroporation bilatérale 26 a l&#39;avantage d&#39;un effet probable plus grande sur le comportement, il est aussi plus la mortalité des embryons. Électroporation unilatérale a été choisie afin de comparer les deux hémisphères avec un comme un contrôle interne, ainsi que pour montrer que même manipulation IUE dans un unilatérale, petite région est suffisante pour changer les comportements. Changements IUE-induits de la connectivité ou de l&#39;architecture entre les neurones peuvent donc être induits sans évoquer une lésion et le match requise de la région-à-être IUE manipulé avec le test de comportement approprié dépend de la question scientifique. Dépannage Taille de la portée réduite Il existe plusieurs suggestions concernant l&#39;augmentation de la survie des petits IUE. Tout d&#39;abord, l&#39;utilisation de très minces tubes capillaires en verre lors de l&#39;électroporation de manière à minimiser Lesio tissulairen est recommandé. Deuxièmement, ne pas électroporer le premier embryon à la fin vaginale de chaque corne de l&#39;utérus: mort du premier-né embryon augmente les chances d&#39;un abandon de toutes les autres embryons. Troisièmement, après la naissance, les rats mères tuent souvent partie de leur progéniture à cause du stress périnatal. Afin de réduire le stress supplémentaire, ne pas commencer par l&#39;imagerie en temps réel juste après la naissance, mais d&#39;attendre sept jours. Détection GFP-fluorescence des chiots Une semaine après la naissance, aucun signal de fluorescence, soit en utilisant la fluorescence binoculaire en direct l&#39;imagerie microscopique ou l&#39;imagerie de fluorescence avec le SIIV spectre (les modes d&#39;épifluorescence et transfluorescence; GFP excitation / émission: 465/520 nm et 500/540 nm). Il est possible que les deux, la transmission limitée de courte longueur d&#39;onde d&#39;excitation et d&#39;émission de lumière à travers les tissus comme le crâne et le bruit de fond élevé d&#39;autofluorescence de la peau prévenir en utilisant la fluorescence sous la described conditions chez le rat. Comme le montre la figure 6, le signal de la luciférase dans l&#39;animal vivant peut également être détectée dans le cerveau disséqué (sans crâne) et là, également un signal de fluorescence est détectable (Figure 6D). La différenciation de la bioluminescence dans les zones du cerveau étroitement espacés Même dans l&#39;illustration 3D de l&#39;emplacement de la zone de bioluminescence ne peut être prédit à 100%. En particulier les cellules au-dessus ou au-dessous de la zone prévue peuvent également être ciblés accidentellement et transfectées. La position exacte doit être contrôlée par l&#39;autopsie (fluorescence) histologie (voir Figure 7).

Le développement de l&#39;électroporation in utero de procédé (IUE) qui permet une modulation de l&#39;expression des gènes dans le cerveau en développement, a été percée, car il a permis d&#39;étudier le développement neurologique avec une relative facilité. 07.01 variations de niveaux d&#39;un gène cible dans l&#39;expression une région spécifique du cerveau au cours du développement embryonnaire et / ou périnatale chez les rongeurs ont été démontrées de façon critique la prolifération neuronale influence, la migration, l&#39;arborisation, et la connectivité. 8-10 La schizophrénie est une maladie mentale complexe avec des symptômes aigus et chroniques qui ont été liées à des anomalies du développement neurologique 11, 12 et donc un grand nombre de gènes candidats identifiés pour la schizophrénie sont étudiés les effets de modulation potentiels sur le développement neurologique, comme par exemple pour le perturbé en schizophrénie -1 (DISC1) gène 13-15. Le développement du cerveau est regulated par des facteurs génétiques et de leurs interactions avec l&#39;environnement qui jouent un rôle dans, pré-périodes de développement péri-et post-natales. Un important facteur de risque génétique pour différents troubles du comportement sont les DISC1 16 gène. DISC1 fils knockdown à des défauts de migration chez la souris 13, 17, et la manipulation de l&#39;expression de DISC1 dans le cortex en développement par l&#39;IUE a été montré pour influer sur le comportement de souris adultes 18. La manipulation de l&#39;expression des gènes du cerveau par IUE présente plusieurs avantages par 19 rapport à la génération de lignées d&#39;animaux transgéniques. Tout d&#39;abord, l&#39;expression des gènes dans des domaines d&#39;intérêt est obtenue en quelques semaines à plusieurs mois plutôt que plusieurs générations d&#39;élevage de rongeurs transgéniques lignes. Deuxièmement, des mécanismes de compensation au cours du développement précoce qui peut bouclier phénotypes chez les animaux de la lignée germinale ingénierie 20 sont évités. Troisièmement, en ciblant uniquement une population cellulaire spécifique ou une zone spécifique du cerveau, migratiou des différences de prolifération peuvent être directement comparés avec le non-mutant ou contrôlent côté controlatéral si électroporations unilatérales sont choisis. D&#39;autre part, IUE n&#39;a pas la précision de cre / lox moment induit-promoteur-driven d&#39;expression et seulement une sous-population de cellules dans un certain domaine est ciblée qui conduit à une sorte de mosaïque de motif d&#39;expression génique. Pour de nombreuses applications expérimentales chez les rongeurs adultes, une transfection transitoire d&#39;un nombre limité de cellules dans une région du cerveau peut être suffisante, voire souhaitée, de sorte que le principal avantage de la lignée germinale, les rongeurs transgéniques stables est négligeable. En fait, l&#39;IUE est utile d&#39;examiner si certaines cellules anormalement développés peuvent affecter tout un réseau de cellules ou de circuits. Un autre avantage pourrait être la capacité à démontrer des effets non de cellules-autonome d&#39;un gène en raison de la nature de la mosaïque de la frappe. En outre, la génération de rats transgéniques et knock-out est encore à ses débuts et l&#39;utilisationde l&#39;IUE dans cette espèce pour l&#39;étude des conséquences aberrantes de développement du cerveau est d&#39;un grand intérêt. Jusqu&#39;à présent, un obstacle majeur à l&#39;aide de l&#39;IUE pour étudier les conséquences de l&#39;intervention dans les animaux que les adultes, c&#39;est le manque de succès de l&#39;électroporation de surveillance. Jusqu&#39;à présent, GFP-co-transfectée dans les neurones fluorescents rats nouveau-nés vivants ne pouvaient pas être détectés par fluorescence sous un microscope binoculaire convenable ou avec l&#39;imagerie de fluorescence du spectre IVIS. Pour surmonter cet obstacle, on co-transfecté un gène rapporteur de la luciférase et effectué bioluminescence imagerie en temps réel des chiots par trois dimensions (3D) la quantification de la zone du cerveau IUE. A titre d&#39;exemple pour démontrer l&#39;applicabilité de ce procédé dans une analyse fonctionnelle ultérieure tester la manipulation génétique du développement neurologique, une co-injection de plasmides contenant DISC1 humain, la luciférase, et la GFP dans le ventricule latéral d&#39;embryons de rat <sup&gt; 3 suivie par électroporation avec une électrode de type brucelles a été effectuée. Bien que les signaux de fluorescence n&#39;a été détectée dans les stades post-natales in vivo, d&#39;un signal de bioluminescence solide dérivé de la luciférine par métabolisme gène de la luciférase a été co-transfecté détectée jusqu&#39;à cinq semaines après la naissance. 3D-mesures de la zone du cerveau a permis de quantifier électroporation lequel chiots avec électroporation insuffisante ou égarés ont été identifiés dès le départ, donc, permettant l&#39;affectation des animaux IUE (gène d&#39;intérêt et brouillés contrôle) à des groupes expérimentaux avec appariés zones du cerveau électroporation de faible variabilité . L&#39;utilisation de rats IUE adultes paradigmes comportementaux a été démontrée comme un exemple de l&#39;utilité de ce protocole.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

Électroporation in utero (IUE) est une technique qui permet la modification génétique de cellules dans le cerveau pour étudier le développement neuronal. Jusqu&#39;à présent, l&#39;utilisation de l&#39;IUE pour étudier le comportement ou la neuropathologie dans le cerveau adulte a été limitée par des méthodes insuffisantes pour la surveillance de l&#39;IUE succès de la transfection par des techniques non-invasives chez les animaux postnatales. Pour la présente étude, des rats ont été utilisés pour E16 IUE. Après l&#39;injection intra-ventriculaire des acides nucléiques dans les embryons, le positionnement des électrodes de la pince était critique pour le ciblage ou l&#39;autre développement du cortex ou de l&#39;hippocampe. Ventriculaire co-injection et l&#39;électroporation d&#39;un gène de la luciférase a permis la surveillance des cellules transfectées après la naissance, après injection intra-péritonéale de la luciférine dans le P7 direct pup anesthésiés par bioluminescence in vivo, en utilisant un dispositif IVIS spectre avec un logiciel de quantification 3D. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Définition de zone par bioluminescence pourrait distinguer clairement électroporations corticales et hippocampiques et détecter un signal longitudinalement au fil du temps jusqu&#39;à 5 semaines après la naissance. Cette technique d&#39;imagerie nous a permis de sélectionner les chiots avec un nombre suffisant de cellules transfectées assumées nécessaire pour déclencher des effets biologiques et, par la suite, d&#39;effectuer des enquêtes de comportement à trois mois de l&#39;âge. A titre d&#39;exemple, cette étude démontre que IUE avec le gène DISC1 humain de pleine longueur dans le cortex de rat a entraîné une hypersensibilité amphétamine. GFP co-transfectées a pu être détectée dans les neurones post-mortem par microscopie à fluorescence dans cryosections indiquant l&#39;expression des gènes présents à ≥ 6 mois après la naissance. Nous concluons que l&#39;imagerie par bioluminescence postnatale permet d&#39;évaluer le succès de transfections transitoires avec IUE chez les rats. Enquêtes sur l&#39;influence des manipulations génétiques d&#39;actualité pendant neurodevelopment sur le cerveau adulte et sa connectivité sont grandement facilitée. Pour de nombreuses questions scientifiques, cette technique peut compléter ou même remplacer l&#39;utilisation de rats transgéniques et de fournir une nouvelle technologie pour les neurosciences comportementales.

<html> La figure 3 montre vivent mesures d&#39;imagerie de trois ratons à P7 après l&#39;injection de 150 mg de luciférine / kg de poids corporel. Les différences d&#39;intensité de signal indiquant la variabilité dans l&#39;efficacité de l&#39;IUE sont visibles. Signaux de bioluminescence fortes ont été enregistrées jusqu&#39;à P36 (Figure 4). Sur la figure 5, la possibilité de définir cortical (Figures 5A et 5C) et de l&#39;hippocampe (Figures 5B et 5D) par électroporation imagerie par bioluminescence sont représentés. Corrélation du signal de bioluminescence (figure 7A) avec son signal de fluorescence après l&#39;enlèvement du crâne (figure 7B) et les cellules GFP-électroporation correspondantes dans le cerveau cryosectioned (figure 8) à P14 sont représentés sur les figures 6-8. Noter, il n&#39;y avait pas détection d&#39;un signal de fluorescence dans des rats vivants à n&#39;importe quel point dans le temps. tente &quot;&gt; In vivo imagerie par bioluminescence permet discrimination approximative de différentes zones du cerveau électroporées en 2D (Figures 5A et 5B), qui est nettement améliorée grâce au programme de DLIT du logiciel IVIS spectre générant des images 3D (figures 5C et 5D). Dans les exemples représentés , électroporation du cortex préfrontal et l&#39;hippocampe pouvait être distinguée. Il convient de noter que, bien que le but de l&#39;électroporation de l&#39;hippocampe, des cellules progénitrices de la corticale dorsale se trouvant de l&#39;hippocampe peuvent également être touchés (Figure 7). Rats unilatéralement in utero électroporation avec pCAX vecteur dans le cortex et la suite surexprimant longueur DISC1 humaine ont été étudiés à la fois spontanée et l&#39;hyperactivité induite par l&#39;amphétamine comme des adultes. Rats électroporation avec pCAX-DISC1 étaient hypersensibles à une faible dose d&#39;amphétamine. Ces rats déplacés considérablement more après le traitement de l&#39;amphétamine après l&#39;injection de sérum physiologique, alors que les animaux témoins ne l&#39;a pas (figure 10). <img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> Figure 1. Système de mesure d&#39;électrode pour A) et B électroporation cortex) électroporation hippocampique; vert = injecté à l&#39;intérieur de l&#39;ADN-Mix le ventricule. <img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> Figure 2. réaction de la luciférase. <img alt="Figure 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> Figure 3. la mesure de la luminescence de rats P7 après l&#39;injection de 150 mg / kg de poids corporel luciférine; temps d&#39;exposition de 180 secondes; A) chez le rat avec des pas de signal de luminescence; B) rat<html> avec un signal de bioluminescence faible, C) chez le rat avec un fort signal de luminescence. <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> Figure 4. Ligne du temps des mesures de bioluminescence consécutives de la même rat après injection de 150 mg / kg luciférine démontrant une grande fenêtre de temps où le succès IUE peut être détectée. <img alt="Figure 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> . Figure 5 Illustration des différences entre électroporation corticale et hippocampique à P7 A) et B) images 2D;. C) et D) des images en 3D, A) et C) de cortex; B) et D) de l&#39;hippocampe.files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir la figure. <img alt="Figure 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> Figure 6. Illustration de E16 électroporation de l&#39;hippocampe d&#39;un chiot de rat à P14 A) 2D image de bioluminescence B) Illustration 3D du signal bioluminescence C) disséqué cerveau avec bioluminescence signal D) cerveau avec la GFP signaux épi-fluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> Figure 7. Détail d&#39;une image de fluorescence à partir d&#39;une section de cryo 20 um de la même cerveau de rat P14 électroporation avec la GFP et la luciférase contenant le plasmidevecteur, noyaux coloration avec DAPI; CA1-3 = corne d&#39;Ammon 1-3; DG = gyrus denté; FC = Fasciolarum cinereum. Vidéo 1. Animation 3D d&#39;un hippocampe électroporation rat à P14. <img alt="Figure 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> Figure 8. Amphétamine procédure de test: injection de solution saline premier jour avant le procès de 15 min, 24 heures plus tard amphétamine injection avant l&#39;essai dans la chambre de plein champ. <img alt="Figure 9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> Figure 9. test de l&#39;amphétamine. Diagramme à barres montrant la distance parcourue (en cm) de l&#39;animal enregistré par un système TrueScan plus de 15 min barres blanches = groupe de contrôle;. Barres grises = groupe surexprimant DISC1; groupe témoin n = 10; DISC1 groupe surexpression n = 11; ANOVA: Geno * p = 0,043 traitement, T-Test pour le sérum de temps total vs ns d&#39;amphétamine = pas de Pcontrol importante = 0,172, pDISC1 = 0,001.

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Les gènes peuvent être manipulés au cours du développement du cortex ou de l&#39;hippocampe du rat par électroporation in utero (IUE) à E16, pour permettre des modifications rapides et ciblées en matière de connectivité neuronale à des études ultérieures de comportement ou la neuropathologie chez les animaux adultes. Postnatal l&#39;imagerie in vivo pour le contrôle de succès IUE est effectuée par la bioluminescence de l&#39;activation de la luciférase co-transfecté.

Génération de rats transgéniques par voie topique<em&gt; In utero</em&gt; L&#39;électroporation et<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescence dépistage

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K vues.  Medical School Düsseldorf.  Les gènes peuvent être manipulés au cours du développement du cortex ou de l'hippocampe du rat par électroporation in utero (IUE) à E16, pour permettre des modifications rapides et ciblées en matière de connectivité neuronale à des études ultérieures de comportement ou la neuropathologie chez les animaux adultes. Postnatal l'imagerie in vivo pour le contrôle de succès IUE est effectuée par la bioluminescence de l'activation de...

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

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Neurosciences

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Manipulation génétique de la souris en développement à travers l&#39;hypothalamus<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.