Le travail dans le laboratoire est financé par Hammarlund: subventions des NIH R01-01 et NS066082 T32GM007223, la Fondation Beekman, et la Ellison Medical Foundation.

1. Assemblage du système Les composants spécifiques de notre système sont décrites ci-dessous. Lorsqu&#39;il est correctement assemblé, l&#39;utilisateur doit être capable de se concentrer au microscope d&#39;une seule main, déplacer la scène avec l&#39;autre (que ce soit avec la souris ou le joystick), activer le laser avec la pédale, et avoir une vue claire de la sur- image à l&#39;écran. <ol><li> MicroPoint laser monté sur le port épifluorescence d&#39;un microscope composé. Nous utilisons un Nikon 80i, mais toute la portée des recherches de qualité droite ou inversée devrait fonctionner. Le système comprendra une MicroPoint dichroïques personnalisés, ce qui devrait correspondre au fluorophore que les étiquettes les cellules dont vous voulez couper. Cellules marquées par des fluorophores coupe alternatif exige dichroïques supplémentaire. En outre, un générateur d&#39;impulsions et pédale fournis avec le système MicroPoint. </li><li> 100x, objectif 1,4 huile de NA pour pratiquer la chirurgie et l&#39;évaluation de la régénération, ainsi que des objectifs supplémentaires que nécessaire pour placer l&#39;échantillon sur la lame. Nous utilisons un plan de Nikon Apo VC pour la chirurgie, et de trouver qu&#39;un 4x est utile de se concentrer grossier et trouver de l&#39;échantillon. </li><li> Motorisé scène avec le joystick. Une scène avec une précision extrêmement élevée et la répétabilité est inutile, puisque la scène est seulement utilisé pour le ciblage. Nous utilisons un Avant OptiScan II (voir la discussion). </li><li> Caméra. La caméra doit fournir une cadence suffisante pour concentrer et cibler les neurites étiquetés avec l&#39;objectif 100x, tout en visualisant l&#39;image sur l&#39;écran d&#39;ordinateur. Nous préférons atténuant la lumière d&#39;éclairage lors de la procédure axotomie pour éviter d&#39;éventuels effets confondants de la photo-blanchiment ou de dommages (voir 1.7, ci-dessous). Ainsi, la caméra doit être suffisamment sensible pour s&#39;adapter à ce niveau de lumière réduite. Nous utilisons un Hamamatsu Orca 05G, et trouver que l&#39;imagerie à 16,3 Hz est suffisante. Equivalent caméras pourraient être substitués. </li><li> Logiciels d&#39;ordinateurs, de surveiller et d&#39;imagerie qui peut piloter la caméra. De plus, nous utilisons le logiciel d&#39;imagerie à manipuler la platine motorisée avec une souris (voir la discussion). </li><li> Tableau de l&#39;Air. Cette exigence peut varier selon l&#39;emplacement, mais depuis la chirurgie est réalisée avec un objectif 100x, on trouve l&#39;isolement de vibration pour être indispensable. </li><li> Approvisionnement léger avec guide de lumière et le mécanisme de l&#39;obturateur pour éclairer le fluorophore. Le guide de lumière va attacher à la MicroPoint. Le mécanisme de l&#39;obturateur est utile pour réduire l&#39;intensité d&#39;éclairage indépendamment du laser. Nous utilisons un Avant Lumen 200 ou un Leica EL6000, et atténuer jusqu&#39;à 80% de l&#39;intensité lumineuse totale pour axotomie. </li></ol> 2. Configuration laser Un protocole détaillé d&#39;abord aligner et centrer le laser est fourni avec le système laser MicroPoint. Nous supposons que la procédure a été suivie avec succès lors de l&#39;installation initiale. Cela comprend l&#39;alignement des lasers avec la ligne de mire dans l&#39;oculaire. Ici nous fournissons un protocole pour l&#39;entretien régulier de focalisation du laser et l&#39;intensité. Comme indiqué dans le manuel MicroPoint, le laser à azote pulsé est capable de d&#39;endommager gravement l&#39;oeil humain. Il faut prendre soin de ne jamais regarder directement le faisceau laser. Une fois installé, le filtre barrière doit bloquer les rayons en toute sécurité à travers les oculaires. Couper les neurones dans un organisme de la taille d&#39;un grain de sable peut être difficile. Depuis la zone de dégâts infligés par le laser est très faible, il est essentiel de connaître la localisation en trois dimensions de l&#39;accent du laser afin de cibler précisément l&#39;échantillon. La focalisation du laser est trouvé en utilisant la lame en miroir. Tout d&#39;abord, nous vérifions que l&#39;emplacement z de la focalisation du laser correspond à l&#39;objet de la voie d&#39;imagerie. Ensuite, l&#39;emplacement en xy de l&#39;accent des dommages est marqué avec réticule dans le logiciel d&#39;imagerie. Mise au point dans le plan z <ol><li> Poussez dans le neutre de densité du filtre ND16 (figure 1a). Nous utilisons des filtres de densité neutre dans le chemin épi-illumination à atténuer le laser tout en se concentrant. Pour encore plus fine se concentrant, pousser à la fois dans l&#39;ND16 et ND4 filtres fluorescents. </li><li> Réglez le laser MicroPoint d&#39;une impulsion avec l&#39;interrupteur tourné vers &#39;Select&#39; (figure 1b), puis déplacez la roue de filtre à la longue barrière appropriée filtre passe-(figure 1c). </li><li> Placer la lame en miroir sur la scène et se concentrer sur son sein trous avec l&#39;objectif 4X en utilisant la lumière transmise. </li><li> Ajouter une goutte d&#39;huile d&#39;immersion à la diapositive en miroir et se recentrer sur trous avec l&#39;objectif 100X. Ouvrez l&#39;obturateur de caméra avec le chemin optique de commutation de levier (Figure 1d) et l&#39;obturateur laser (figure 1e). Si nécessaire, réduire l&#39;intensité lumineuse transmise pour que les bords des trous d&#39;épingle sont nettes: ce sera l&#39;aide à se concentrer exactement. </li><li> Appuyez sur la pédale. Ceci devrait produire un petit trou dans le miroir si le laser est focalisé correctement. </li><li> Focus du microscope, légèrement au-dessus du plan de la diapositive en miroir et tirer à nouveau le laser. Cela devrait faire un encore plus petittrou que le premier coup, ou ne laissent aucune trace du tout. Répétez en se concentrant sous la diapositive en miroir. </li><li> Si un trou n&#39;est pas produit en 2.5, ou si un plus grand trou est produite lorsque nous nous concentrons ci-dessus ou en dessous de la surface du miroir, de recentrer le laser avec la bague de mise sur la tête d&#39;ablation. Vérifiez que le trou est toujours bien aligné avec la ligne de mire dans l&#39;oculaire. Avec une utilisation cohérente, l&#39;accent plan z rarement besoin d&#39;être ajusté. </li></ol> Mise au point dans le plan xy <ol start="8"><li> Suivez les étapes 2.1 à 2.3 ci-dessus et appuyez sur la pédale pour faire un petit trou dans la diapositive miroir. </li><li> Initier &#39;Live&#39; mode de capture de «acquérir» des éléments du menu. Dans la «mesure» la barre d&#39;outils sélectionnez &#39;ROI&#39; éditeur, puis sélectionnez l&#39;outil &quot;double croix&quot; et faites glisser le réticule pour les aligner avec le centre du trou de nouvelles. Cliquez sur &#39;Enregistrer ROI&#39; Quitter éditeur &#39;et ensuite et reprendre le mode de capture en direct. </li><li> Activez le réglage «souris XY&quot; dans les éléments à manipuler la scène avec la souris. </li><li> Tirez le filtre à densité neutre (s) à la position originale (s), définissez la impulsions laser à 10, et retirer la lame miroir. </li></ol> Réglage de la puissance du laser <ol start="12"><li> La puissance du laser doit être ajustée à la puissance minimum nécessaire pour couper le neurone de votre choix. Réglez la puissance en déplaçant la plaque atténuateur (figure 1f) tout en coupant vers vivants (décrit ci-dessous). Si la puissance du laser est trop élevé, il causera des dommages périphériques ou le souffle d&#39;un trou dans le ver. Si la puissance du laser est trop faible, il ne sera pas rompre le neurone. Une fois que le système a été mis en place, la position atténuateur rarement besoin d&#39;être changé. Si le laser devient faible, et la plaque atténuateur doit être déplacé de continuer à réduire, il pourrait être un signe que le colorant dans la cellule de teinture doit être remplacé (voir la discussion). </li></ol> 3. Immobiliser les vers <ol><li> Préparer une solution de 3% agarose fondu dans le M9 (KH2PO4 22mm, 42mm Na2HPO4, 85mm de NaCl, 1 mM MgSO4). Distribuer 5 ml d&#39;agarose fondu dans un tube Falcon de 15 ml. Remplir un autre tube avec de l&#39;eau. Placer les tubes dans un élément de chauffage modulaire mis à 55 ° C. Remplir l&#39;élément chauffant à l&#39;eau pour créer des bains d&#39;eau mini pour chaque tube. Remarque: agarose peuvent être préparés en grande quantité à l&#39;avance et refondu pour des expériences ultérieures. </li><li> Placez deux couches de ruban d&#39;étiquetage sur chacun des deux lames et une lame propre entre ces diapositives. Verser une goutte d&#39;agarose en utilisant une pipette ampoule en plastique pour le milieu de la lame propre et placer une autre perpendiculaire à la première glissière de sorte que la résultante d&#39;agarose pad est l&#39;épaisseur de deux morceaux de ruban adhésif (figure 2). Retirez l&#39;une des deux lames du pavé après 30 secondes. Rincez et stocker la pipette en plastique dans le tube rempli d&#39;eau pour une utilisation avec le faucon diapositives suivantes. </li><li> Ensuite, placez 3-5 uL de 0,10 ou 0,05 um um billes de polystyrène au centre du pad. Ajouter les vers 50-10 exprimant la protéine fluorescente dans les neurones d&#39;intérêt. Si les neurones d&#39;intérêt sont asymétriquement distribuées sur le côté droit ou gauche du ver, utiliser un pick platine pour retourner vers telle sorte que le bon côté vers le haut. Worms doivent être placées sur des lames dans les 10 minutes de préparation des plaquettes d&#39;agarose. </li><li> Placez délicatement une lamelle sur le vers. Après avoir placé la lamelle, ne pas le déplacer par rapport à la plaquette d&#39;agarose comme cela va bouleverser la cuticule et de détruire les vers. Placer la lame préparée sur la platine du microscope. </li></ol> 4. Couper les neurones <ol><li> La lumière directe dans les oculaires avec le levier de commutation du chemin optique. Focus sur le ver à couper avec l&#39;objectif 4X, déposer une goutte d&#39;huile sur la lamelle, et passer à l&#39;objectif 100X. Retour sur le trajet optique de la caméra. </li><li> Utilisez la souris pour déplacer le neurone de votre choix sous le centre du réticule. Appuyez sur la pédale au feu du laser et de rompre le processus neuronaux. Si nécessaire, deux ensembles d&#39;impulsions peuvent être utilisées pour couper les neurones. Dans un premier temps, il est utile de suivre précisément les neurones ont été rompus dans les vers individuels afin d&#39;évaluer la régénération ultérieure. Quand elle est réalisée correctement, laser axotomie produit une petite pause dans le neurone sans causer des dommages importants aux tissus de la peau environnante ou d&#39;autres neurones (voir figure 3). Dans certains cas, une petite cicatrice peut se former autour du site de la lésion. </li><li> Récupérer les vers en supprimant la lamelle dans un mouvement direct vers le haut, en faisant attention que les vers restent sur le pavé d&#39;agarose. Ne faites pas glisser la lamelle hors tension. Ensuite, coupez le pavé autour de l&#39;aiguille vers avec une pince-nez et le lieu de la section d&#39;agarose sur une plaque fraîchement ensemencé contenant NGM OP50 8. Placer 10 uL de solution stérile M9 sur le pad pour libérer les vers des billes d&#39;agarose et retirez. </li></ol> 5. Score à la régénération des neurones <ol><li> Préparer agarose pad tel que décrit dans l&#39;étape 2.2. </li><li> Placez les vers dans 3-5 &amp;mu; L de billes de polystyrène. Appliquer une lamelle. Les diapositives peuvent être préparés de façon séquentielle, ou bien tous les vers peuvent être préparées à l&#39;avance et les diapositives conservées dans des boîtes de culture 10 cm, contenant chacune une Kimwipe humide pour conserver l&#39;humidité agarose. </li><li> Utiliser l&#39;objectif 100X pour visualiser les neurones rompus. Dans de nombreux neurones, une souche neuronale distale vers le site restera coupée. Nous utilisons la présence de ce vestige comme une indication que le neurone était en effet rompu (Figure 4). La présence de cette souche, il est possible de distinguer un neurone qui a été coupé et régénérés à partir de celui qui n&#39;a pas été coupé. Remarque: les deux souches distale et proximale d&#39;abord rétracter après avoir été coupé. </li><li> Évaluer la régénération. Une variété de paramètres peuvent être déterminés. Un test simple est de savoir si le neurone lésé a formé un cône de croissance (figure 4a) et régénéré, ou non (figure 4b). Alternativement, la longueur des neurites peut être tracée et comparée. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Comme exemple, nous décrivons la caractérisation de la régénération de l&#39;acide γ-aminobutyrique (GABA) neurones moteurs. Ces neurones, qui résident dans la corde nerveuse ventrale et d&#39;étendre les processus circonférentiellement à la moelle nerf dorsal, sont essentiels pour la locomotion appropriés 9. Neurones GABA peuvent être visualisées en exprimant un fluorophore génétiquement codés, tels que la protéine fluorescente verte (GFP), sous le contrôle de l&#39;-47 UNC ou UNC -25 promoteurs (souches EG1285 et CZ1200, respectivement, disponible au Centre de génétique de C. elegans ). Mont-L4 étape vers tel que décrit, retournez le ver de sorte que le GABA des neurones sur le côté droit sont vers le haut, et placer la lamelle. Couper 1-3 de la commissure postérieure de chaque ver, à mi-chemin entre les cordes dorsales et ventrales. Évitez de couper des commissures qui traversent ou fasciculées aux commissures d&#39;autres, comme elles sont difficiles à marquer plus tard. Récupérez des vers tels que décrits. 18 à 24 heures après une axotomie réussie, le ver aura récupéré de la chirurgie et d&#39;exposition de locomotion normale et la ponte des comportements. Jeter les vers qui sont morts ou malades. Remontez le reste comme décrit, et d&#39;évaluer la régénération. Nous visent généralement à évaluer au moins 30 neurones coupé par condition expérimentale. En oxIs12 animaux, généralement 60-70% de L4 rompu neurones GABA aura initié une structure de cône de croissance, comme en témoigne l&#39;élargissement de la membrane à la pointe et l&#39;extension de succursales neurites plusieurs années, et ont migré à partir du site coupés (figure 4a). Dans de nombreux cas, les cônes de croissance aura migré à renouer avec la moelle épinière dorsale, une commissure adjacentes neuronaux, ou le moignon distal. Les 30% restants de neurones aura soit initiée sans croissance, formant un moignon proximal sur le site de axotomie, ou auront prolongé que de petites filopodes (figure 4b). <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Le laser pulsé UV axotomie système. Composants spécifiques sont: (a) Les filtres ND (b) impulsion de sélecteur (c) levier de roue à filtres (d) du chemin optique de commutation de levier (e) d&#39;obturation au laser et (f) la plaque d&#39;atténuateur. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Préparation d&#39;un pad d&#39;agarose. Pour préparer un tampon d&#39;agarose de l&#39;épaisseur désirée, deux couches de ruban (vert) sont placés sur deux lames. Une lame est placée entre les deux premiers, et une goutte d&#39;agarose est alors ajouté à la lame propre. Enfin, un quatrième diapositive est placé perpendiculairement aux trois premiers, résultant en un pad qui est l&#39;épaisseur de deux morceaux de ruban. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Représentant GABA axotomies neurone. Dans une expérience typique, le GABA neurone commissures sont sectionnés au milieu de la face latérale du ver. Une commissure coupé est montré juste avant (à gauche) et après (à droite) axotomie. Toutes les images ont été prises avec un objectif 100x. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Des résultats représentatifs de axotomies neurone GABA. 24 h après l&#39;axotomie axones sectionnés sont marqué pour la régénération. Un axone régénérer avec un cône de croissance (flèche) est montré en (a) alors qu&#39;un non-régénération des axones est considéré comme un moignon proximal (flèche) en (b). Le moignon distal de chaque axone coupé est montré dans chaque panneau (tête de flèche) et est une indication que l&#39;axone a été sectionné.

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	<li>Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+regeneration+requires+a+conserved+MAP+kinase+pathway.">Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway.</a> Science. 323, 802-806 (2009).</li><li>Ghosh-Roy, A., Wu, Z., Goncharov, A., Jin, Y., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+Cyclic+AMP+Promote+Axonal+Regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+and+Require+DLK-1+Kinase.">Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase.</a> Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage,+ephrin+signaling,+and+synaptic+branchi+ng.">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branchi ng.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 15132-15137 (2007).</li><li>Yan, D., Wu, Z., Chisholm, A. D., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DLK-1+Kinase+Promotes+mRNA+Stability+and+Local+Translation+in+C.+elegans+Synapses+and+Axon+Regeneration.">The DLK-1 Kinase Promotes mRNA Stability and Local Translation in C. elegans Synapses and Axon Regeneration.</a> Cell. 138, 1005-1018 (2009).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+Functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: Functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Gabel, C. V., Antoine, F., Chuang, C., Samuel, A. D. T., Chang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+nanosecond+laser+axotomy:+cavitation+dynamics+and+vesicle+transport.">In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport.</a> Optics Express. 16, 9884-9894 (2008).</li><li>Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nematode+Caenorhabditis+Elegans.">The Nematode Caenorhabditis Elegans.</a> , (1988).</li><li>McLntire, S. L., Jorgensen, E., Kaplan, J., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABAergic+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">The GABAergic nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 364, 337-341 (1993).</li><li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in.">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in.</a> C. elegans. Optics Express. 15, 8521-8531 (2007).</li><li>Chung, S., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies.">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Applied Physics A: Materials Science &#38; Processing. 96, 335-341 (2009).</li><li>Steinmeyer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+femtosecond+laser+microsurgery+system.">Construction of a femtosecond laser microsurgery system.</a> Nature Protocols. 5, 395-407 (2010).</li><li>Wang, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+axon+regeneration.+Current+Opinion+in+Neurobiology.">Genetic dissection of axon regeneration. Current Opinion in Neurobiology.</a> , (2010).</li><li>Huang, X., Cheng, H. -. J., Tessier-Lavigne, M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAX-1,+a+Novel+PH/MyTH4/FERM+Domain+Cytoplasmic+Protein+Implicated+in+Netrin-Mediated+Axon+Repulsion.">MAX-1, a Novel PH/MyTH4/FERM Domain Cytoplasmic Protein Implicated in Netrin-Mediated Axon Repulsion.</a> Neuron. 34, 563-576 (2002).</li><li>McIntire, S. L., Reimer, R. J., Schuske, K., Edwards, R. H., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+the+vesicular+GABA+transporter.">Identification and characterization of the vesicular GABA transporter.</a> Nature. 389, 870-876 (1997).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser microsurgery in C. elegans in Methods in Cell Biology: Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , .</li><li>Guo, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies.">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5, 531-533 (2008).</li><li>Zeng, F., Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+precision+on-chip+small-animal+immobilization,+multi-photon+imaging+and+femtosecond-laser+manipulation.">Sub-cellular precision on-chip small-animal immobilization, multi-photon imaging and femtosecond-laser manipulation.</a> Lab on a Chip. 8, 653-656 (2008).</li><li>Rohde, C. B., Zeng, F., Gonzalez-Rubio, R., Angel, M., Yanik, M. F., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+on-chip+high-throughput+whole-animal+sorting+and+screening+at+subcellular+resolution.">Microfluidic system for on-chip high-throughput whole-animal sorting and screening at subcellular resolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 13891-13895 (2007).</li><li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans.">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7, 1515-1523 (2007).</li><li>Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+the+analysis+of+behavior,+nerve+regeneration,+and+neural+cell+biology+in+C.+elegans.">Microfluidics for the analysis of behavior, nerve regeneration, and neural cell biology in C. elegans.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 561-567 (2009).</li><li>Samara, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+in+vivo+femtosecond+laser+neurosurgery+screen+reveals+small-molecule+enhancer+of+regeneration.">Large-scale in vivo femtosecond laser neurosurgery screen reveals small-molecule enhancer of regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2010).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> Journal of Experimental Zoology. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+cell+autonomy+during+postembryonic+development+of+Caenorhabditis+elegans.">Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 78, 577-597 (1980).</li><li>Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+cell+lineage+following+laser+ablation+of+cells+in+the+somatic+gonad+of+Caenorhabditis+elegans.">Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 87, 286-300 (1981).</li><li>Allen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Une variété de systèmes laser ont été utilisées pour couper neurites en C. elegans, et plusieurs études ont examiné leurs performances en détail 3,7,10,11. Le laser utilisé MicroPoint dans notre protocole est un système clé en main qui est facile à configurer et à entretenir, et est disponible à un faible coût à des chercheurs par rapport à un système Ti-Sapphire laser. Comparé à un système de Ti-Saphir, cependant, le laser MicroPoint est susceptible de causer des dommages à une zone plus large, qui peut être désavantageux pour certaines applications. Si un système Ti-Saphir est souhaité, un excellent protocole sur la construction d&#39;un tel système est disponible 12. Le protocole actuel peut être effectuée sur une variété de neurones en C. elegans; toutefois, nous notons que les différences de capacités de régénération entre les types distincts de neurones sont attendus 13. En outre, les différents milieux transgéniques peuvent affecter le succès de régénération. Bien que le pourcentage de régénération de neurones GABA est assez uniforme entre les différentes souches marqueur transgénique, nous avons noté une augmentation globale légère de régénération dans juIs76 14 vs 15 oxIs12 vers. Différences entre les marqueurs des neurones tactile ont également été décrites 2. Nous préférons pour immobiliser les vers avec des microbilles, plutôt que des anesthésiques que les perles entraîner plus rapide et plus cohérente l&#39;immobilisation 16. Ceci est également avantageux que nous sommes en mesure d&#39;observer la régénération gratuite de tous les effets possibles de confusion en raison de l&#39;anesthésie 17. Une alternative sans anesthésie méthode pour l&#39;immobilisation est l&#39;utilisation de dispositifs microfluidiques. L&#39;utilisation de la microfluidique pour axotomie a été largement décrite 17-22. Nous constatons que l&#39;utilisation cohérente, les fonctions laser le mieux quand la coumarine 440 dans la cellule colorant est changé une fois par semaine suivant la procédure décrite dans le manuel MicroPoint. Si nécessaire, le curseur d&#39;atténuation peut être utilisé pour augmenter la puissance, mais cela peut être une indication de colorant vieux ou mauvais alignement au laser. En outre, la cellule colorant a une durée de vie limitée et auront éventuellement besoin d&#39;être reconstruit ou remplacé (voir Dépannage). Il peut être difficile à manœuvrer le neurite cible sous la ligne de mire qui marquent la focalisation du laser, en particulier si l&#39;animal n&#39;est pas complètement paralysé. Nous constatons que une étape manuelle n&#39;est pas optimale à cet effet, même si elle est certainement utilisable. Une étape joystick à commande motorisée est plus précis, et nous constatons que l&#39;aide du logiciel qui supporte l&#39;image en faisant glisser avec la souris pour déplacer la platine motorisée est la meilleure. Éléments de Nikon offre cette fonction et est décrite dans ce protocole, mais le package microgestionnaire libre, ainsi que des logiciels d&#39;imagerie, peuvent avoir des fonctionnalités similaires. Une autre façon de cibler amende est de déplacer le focus laser, plutôt que de l&#39;animal. Un galvanomètre faisceau mécanisme de direction est disponible comme un add-on pour le laser MicroPoint, si cette approche est préférable. Outre son application à l&#39;étude de la régénération neuronale, le laser peut être utilisé pour l&#39;ablation d&#39;autres types cellulaires, comme la peau, des muscles ou des cellules spécialisées, ou de perturber spécifiques synapses neuronales 23-27. Par ailleurs, les voies de régulation de la dégénérescence des neurones qui accompagne une blessure ou la maladie pourraient être étudiés avec ce système. En tant que tel, l&#39;utilisation de lasers pulsés continuera à faire la lumière sur les facteurs génétiques et les changements de cellules biologiques qui facilitent la régénération neuronale et d&#39;autres processus pertinents. Dépannage: Décrites ici sont des problèmes courants et leurs solutions associées. <ol type="a"><li> Le laser ne coupe pas correctement. C&#39;est probablement parce que soit le laser est hors de discussion (voir section 2), ou le colorant dans la cellule de teinture doit être remplacé (voir MicroPoint manuel). Alternativement, la cellule de teinture peut-être besoin d&#39;être remplacé ou reconstruit. </li><li> Les vers se déplacent sur ​​agarose pad. Cela est généralement un signe que le tampon d&#39;agarose est trop humide. Nous constatons que coussinets doivent être laissés pendant environ 30 secondes avant vers sont placés sur eux pour contourner ce problème. Vous pouvez également essayer d&#39;utiliser plus la taille (0,05 um) microbilles. </li><li> La reprise de vers est difficile et inefficace. Cela peut être causé par l&#39;enlèvement lamelle incorrecte ou par un tampon sec agarose. Si le tampon est trop sec, vous pouvez remarquer que les axones de développer un aspect perlé. Dans certains cas, c&#39;est parce que les vers ne sont pas mis sur le tapis assez tôt après qu&#39;il a été fait. Alternativement, un ancien stock de solution d&#39;agarose peut avoir une concentration supérieure à 3% après la fusion répétée. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> 0,05 um billes de polystyrène </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0,10 um billes de polystyrène </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose GPG / LE </td><td> Américaine bioanalytiques </td><td> 00972 </td><td> Ultra pur </td></tr><tr><td> Polystyrène Falcon 14 ml à fond rond Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm de style, apyrogène </td></tr><tr><td> Thermo Scientific Plaine des lames de microscope préalablement nettoyées </td><td> Erie Scientific Company </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Lamelles </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm n ° 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Kimwipes sciences </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15mm style boîte de Pétri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Bande vierge 3/4w x 500L </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Huile à immersion </td><td> Nikon </td><td></td><td> Type A, sd = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 ou CZ1200 </td><td> C. elegans génétique Centre </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> Scientifique préalable </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar ou Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Système MicroPoint ablation laser </td><td> Photoniques scientifique </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope composé </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu caméra </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modèle C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC avec Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professionnel </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Version 2002, Série Pack 3 </td></tr><tr><td> Double bain sec Incubateur </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Commandes analogiques </td></tr><tr><td> 4X plan Fluor objectif </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X plan Apo objectif du pétrole VC </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 pince </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel pointes standard, peuvent également utiliser # 7 </td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> Avec NI-150 Illuminateur à haute intensité </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Les neurones communiquent avec d&#39;autres cellules par l&#39;intermédiaire des axones et des dendrites, prolongements de membrane mince qui contiennent des spécialisations pré-ou post-synaptique. Si un neurone est endommagé par une blessure ou une maladie, il peut se régénérer. Cell-facteurs intrinsèques et extrinsèques influencent la capacité d&#39;un neurone à se régénérer et restaurer la fonction. Récemment, le nématode C. elegans a émergé comme un organisme modèle idéal pour identifier les gènes et les voies de signalisation qui influencent la régénération des neurones 1-6. Le principal moyen pour initier la régénération neuronale dans C. elegans est médiée par laser de coupe, ou axotomie. Pendant axotomie, un processus marqué par fluorescence neuronale est rompu à l&#39;aide d&#39;impulsions à haute énergie. Initialement, la régénération neuronale en C. elegans a été examiné en utilisant un laser femtoseconde amplifiée 5. Cependant, les études de régénération ultérieures ont montré que d&#39;un laser pulsé conventionnels peuvent être utilisés pour séparer précisément les neurones in vivo et d&#39;obtenir une réponse semblable régénératrice 1,3,7. Nous présentons un protocole pour la réalisation in vivo laser axotomie dans le ver utilisant une MicroPoint laser pulsé, un système clé en main qui est facilement disponible et qui a été largement utilisée pour l&#39;ablation des cellules ciblées. Nous décrivons aligner le laser, le montage du vers, la coupe des neurones spécifiques, et d&#39;évaluer la régénération ultérieure. Le système offre la possibilité de couper un grand nombre de neurones dans les vers de multiples cours d&#39;une expérience. Ainsi, le laser axotomie comme décrit ici est un système efficace d&#39;initier et d&#39;analyser le processus de régénération.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Un protocole de couper dans les neurones<em&gt; C. elegans</em&gt; Avec un laser pulsé MicroPoint est présenté. Nous décrivons la mise en place du système, immobilisant les vers, et la rupture des neurones marqués. Les avantages comprennent un système relativement peu coûteux et la capacité à rompre les processus neuronaux ou des cellules ablation<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo laser axotomie en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.2K vues.  Yale University School of Medicine. Un protocole de couper dans les neurones C. elegans Avec un laser pulsé MicroPoint est présenté. Nous décrivons la mise en place du système, immobilisant les vers, et la rupture des neurones marqués. Les avantages comprennent un système relativement peu coûteux et la capacité à rompre les processus neuronaux ou des cellules ablation In vivo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

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Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenèse

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgie de cervelet axones<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

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In vivo laser axotomie en C. elegans

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

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Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d'enregistrement de neurones identifiés

Utilisation de neuro-imagerie fonctionnelle par ultrasons rupture de la barrière hémato-encéphalique et le manganèse-IRM

Quantification automatisée de la fluorescence dans Synaptic

C. elegans Suivi et évaluation comportementale

Un indicateur moléculaire de l'adaptation à long terme olfactive dans

En imagerie calcique in vivo des neurones en C. elegans

Visualisation neuroblaste Cytocinèse cours

Laser nanochirurgie de cervelet axones

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