이 방법의 목적은 항원 제시 세포 및 T-도우미 림프구에 의해 형성된 세포 대 세포 컨쥬게이션의 예인 면역학적 시냅스를 생성하는 것입니다. 우리의 목표는 면역 시냅스 형성의 첫 번째 단계를 기록하고 T 도우미 림프구에서 발생하는 인신 매매 사건을 기록하는 것입니다. 이들은 결국 면역 시 냅 스에서 편광 분 비로 이어질 것 이다.
여기에 제시된 접근은 세포 대 세포 연상, 시간 경과 취득, 광야 형광 현미경 검사법 및 후속 심상 처리를 포함합니다. 이렇게 하면 이미지의 신호 대 잡음 비율이 향상되고, 시간적 해상도를 향상시키며, 신흥 시냅스 컨쥬게이트에서 여러 형광을 동시에 획득할 수 있으며 형광 표백을 감소시킵니다. 또한, 이 프로토콜은 면역형광 염색 및 분석을 허용하는 엔드포인트 셀 고정 프로토콜과 호환된다.
이 프로토콜은 또한 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법과 다른 최첨단 현미경 검사기 기술과 호환됩니다. 절차를 시연하는 것은 대학원생 인 아나 벨로, 기술자 알레한드로 가리도, 대학원생 솔란지 모레노가 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 8 개의 마이크로 웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 150 마이크로 리터를 추가하고 30 분에서 1 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
인큐베이션 기간 이후에는 섬유네크틴을 흡인하고 200 마이크로리터의 PVS로 각각 부드럽게 흔들어 보세요. 이 워시를 다시 한 번 반복하고 두 번째 세척을 잘 그대로 둡니다. 15 밀리리터 V-바닥 튜브로 Raji 세포의 수렴 된 사전 배양의 10 밀리리터를 전송합니다.
원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 상체를 버리고 밀리리터 당 1백만 개의 세포 농도로 따뜻하고 완전한 배지에서 셀 펠릿을 부드럽게 재놓습니다. Raji 세포에 라벨을 붙이려면 배양 배지에서 필요한 수의 세포를 2밀리리터 튜브로 이송합니다.
8 개의 마이크로웰 챔버 슬라이드의 경우 총 1.6 밀리리터의 세포 현탁액이 필요합니다. 셀 트래커 블루를 10 마이크로몰러의 최종 농도에 추가합니다. 셀 트래커 블루 스테인드 셀을 다시 중단하고 200 마이크로리터의 셀 서스펜션을 제조된 섬유네틴 코팅 챔버 슬라이드의 각 웰로 옮킨다.
챔버 슬라이드를 섭씨 37도에서 30분에서 1시간 동안 이산화탄소 5%로 배양합니다. 그 후, 챔버 슬라이드를 현미경으로 부드럽게 흔들어 라지 세포가 부착되도록 합니다. 여분의 셀 트래커 블루를 제거하기 위해 따뜻하고 완전한 세포 배양 매체로 각 것을 신중하게 씻으세요.
Raji 셀이 플레이트 의 바닥에 부착되어 서로 간격을 표시하고 컨실티브되지 않도록 합니다. 세포 합류의 50-60%가 적절하다. 먼저, 각 웰에 밀리리터당 1마이크로그램의 농도로 황색포도상구균 엔테로톡신 E를 첨가한다.
라지 세포가 초안티겐으로 펄스되도록 하는것은 그렇지 않으면 Jurkat 세포로부터의 T 세포 수용체가 SCE를 인식하지 못하고 시냅스가 형성되지 않도록 한다. 챔버 슬라이드를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 30분 이상 배양합니다. 다음으로, 밀리미터당 1~200만 개의 세포 사이의 농도로 Jurkat 세포의 이전에 성장하는 배양을 얻습니다.
상 대비 현미경의 밑에 세포를 관찰하고 15 밀리리터 V-바닥 관으로 세포를 전송합니다. 원심분리기는 300배 G, 실온에서 5분간. 상체를 버리고 밀리리터 당 1백만 개의 세포 농도로 따뜻하고 완전한 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재보페합니다.
그런 다음 사용 준비가 될 때까지 5 %의 이산화탄소와 37 섭씨에서 배양에서 Jurkat 세포를 유지합니다. 인큐베이터에서 셀 트래커 블루 라벨황색 표기 장테로톡신 E 펄스 부착 라지 세포를 포함하는 챔버 슬라이드를 검색합니다. 조심스럽게 우물의 구석에 배치 파이펫으로 각각 의 우물에서 배양 매체를 하나씩 흡인.
즉시 세포 배양 배지에서 재중단 된 Jurkat 세포의 200 마이크로 리터로 배지를 교체하십시오. 시간 경과가 수행되는 경우, 신속하게 현미경으로 진행합니다. 현미경 스테이징 웨이터에서 챔버 슬라이드를 찾아 서 몇 가지 적절 한 필드를 선택 합니다.
이미징 전에 현미경 및 인큐베이션 챔버를 준비합니다. Jurkat 세포가 Raji 세포를 포함하는 각 우물에 추가된 후에, 재빨리 예열된 현미경에 마이크로웰드 챔버 슬라이드를 찾아 서열된 인큐베이터를 그리고 몇몇 XY 위치를 선택합니다. 종점 실험만 계획되면 챔버 슬라이드를 섭씨 37도에서 1~2시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다.
문화권 기간이 지나면 컨쥬게이트 형성을 확인하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컨쥬게이트를 수정합니다. 세포를 수정하려면 FCS없이 따뜻한 RPMI를 추가하고 부드럽게 흔들어 주세요. RMPI를 흡인하고 PFA 또는 미리 냉각 된 아세톤 200 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.
실온이나 얼음에서 챔버 슬라이드를 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 PVS로 두 번 잘 씻고 담금질 용액 200 마이크로 리터를 추가하십시오. 이 연구에서는 Jurkat-Raji 면역 시냅스 컨쥬게이트가 생성되고 면역 시냅스 형성의 초기 단계가 제대로 이미지화됩니다.
이 전략은 동시에 시간 경과 이미징을 수행하면서 면역 시냅스 형성을 유도한다. 이 기술에서 얻은 대표적인 시냅스 Jurkat-Raji 컨쥬게이트는 여기에 전송 채널, 셀 트래커 블루 채널 및 이들 채널이 모두 병합된 이미지를 포함한다. 일부 시냅스 컨쥬게이트는 하나의 Jurkat 세포와 복잡한 컨쥬게이트인 여러 Raji 세포로 구성된 것을 포함하여 볼 수 있습니다.
세포 농도를 감소시키는 것은 복잡한 세포 공자의 형성을 우회할 것이지만 편광 트래픽의 후속 분석을 위한 충분한 세포 접점을 제공하지 않을 수 있으며, 이는 차례로 새로운 시냅스 컨쥬게이트를 찾아 서 이미지할 기회를 감소시킬 것이다. GFP-CD63 형광 채널 이미지의 디콘볼루션은 넓은 필드 광학 옵션과 적절한 광학 파라미터를 사용하여 적절한 절충전 소프트웨어로 수행됩니다. 이 deconvoluted 채널은 이후에 셀 트래커 블루 브로드 채널로 병합되었다.
신호 대 잡음 비율과 선명도가 모두 향상되었습니다. 고정된 면역시냅스 컨쥬게이트의 대표적인 Z 스택이 여기에 나와 있다. 면역형광은 P-actin, 안티 CD63를 시각화하기 위해 P할로이드를 사용하여 수행되며, 세포 추적기 블루는 라지 세포에 라벨을 붙인 동안 MTOC를 시각화하기 위해 안티 CD63을 시각화한다.
Jurkat 세포의 선택적 변환은 살아있는 세포에 있는 분비 과립의 트래픽의 시각화를 허용할 것입니다. 예를 들어 GFP-CD63이 표현되면 GFP-CD63 장식 소포의 움직임을 기록할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 면역 불피성 염색 프로토콜 및 분석을 허용하는 엔드 포인트 고정 프로토콜과 호환됩니다.
생산성 실험 모델은 면역 시냅스에서 이미징을 단순화할 수 있지만 이러한 모델은 면역 시냅스에서 비생리적 상호 작용을 생성할 수 있는 항원 발표자 세포에 복잡하고 불규칙한 표면을 모방하지 않습니다. 여기에서 기술된 접근은 면역 시냅스에서 발생하는 몇몇 생물학 복잡성을 재현하고 확인하는 것이 적합합니다. 수퍼 안티겐은 위험한 독소이므로 장갑을 착용하고 사용 된 팁을 위험 상자에 떨어 뜨려주세요.
