이 검토에서는, 우리는 면역학적 시냅스의 형성 도중 관찰된 세포골격 재배열뿐만 아니라 세포재형성을 연구하는 데 사용되는 화상 진찰 및 생화학 기술 둘 다 토론할 것입니다. 활성 리모델링의 초기 단계는 B 세포가 세포 표면을 증가시키고 시냅스에서 수집된 항원 BCR 복합체의 양을 최대화할 수 있게 합니다. 한편, 리소좀의 현지 모집은 시냅스 멤브레인의 중심과 함께, 고정된 항원 추출을 용이하게 하는 것으로 알려진 리소성 분비에 결합될 수 있다.
업제 된 항원은 내막구 내에서 펩티드로 추가로 처리되며, 이는 T 도우미 세포에 대한 프리젠 테이션을 위해 MHC 클래스 II 분자에 로드됩니다. 따라서 면역 시냅스와 관련된 세포역학을 연구하는 것은 B 세포가 어떻게 완전히 활성화되는지 이해하는 데 매우 중요합니다. 고정된 항원으로 활성화된 B 세포의 면역 형광은 우리가 다른 세포 성분을 따르고 면역 시냅스로 모집될 수 있는 방법을 가능하게 합니다.
B 세포는 비드 표면 또는 커버슬립 표면에서 고정된 항원들을 통해 활성화될 수 있다. 항원 코팅 구슬은 이전에 아미노 그룹을 활성화하기 위해 글루타랄데히드로 치료된 아미노 구슬로 특정 리간드를 배양함으로써 제조됩니다. PBS 및 소용돌이의 100 마이크로 리터에서 활성화 된 구슬을 재일시 중단합니다.
한편, PBS의 150 마이크로리터에 BCR 리간드의 mL 당 100 마이크로그램을 추가하여 항원 용액을 준비한다. 다음으로, 항원 용액에 활성화 된 구슬 50 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 또한 관련없는 리간드를 음수 제어로 사용하십시오.
인큐베이션 후 PBS로 구슬을 씻으실 수 있습니다. 슈퍼네티를 흡인하고 PBS로 대체하십시오. 세 번 반복합니다.
다음으로, BSA용액의 500마이크로리터에서 구슬을 재일시 중단하여 3개의 아미노산을 차단한다. 마지막으로 PBS의 70 마이크로 리터에서 구슬을 다시 일시 중단합니다. 최종 농도를 계산하려면 혈안이계를 사용하여 구슬을 계산할 수 있습니다.
B 세포 활성화의 경우 50mL 튜브를 사용하고 5%의 태아 소 혈청으로 보충된 CLICK에서 mL당 150만 개의 농도로 세포를 재중단합니다. 다음으로, 150, 000 B 세포를 추가하여, 다른 시간점에 대해 37도에서 폴리 L-리신 코팅 커버슬립 광고 인큐베이터에 셀 비드 혼합물의 100 마이크로리터에 대응한다. B 세포를 활성화하는 두 번째 접근법은 항원 코팅 커버립에 그들을 파종하는 것입니다.
이를 위해 안티 BCR 및 B220을 가진 코트 슬라이드는 세포 접착력을 향상시킵니다. PBS에 항 BRC 및 B220을 추가하여 mL당 10 마이크로그램과 mL당 0.5 마이크로그램의 최종 농도를 각각 첨가하여 항원 용액을 준비한다. 다음으로, 파라필름 필름으로 덮인 24개의 웰 플레이트 뚜껑 위에 커버슬립을 설정하고 40마이크로리터의 항원 용액을 추가합니다.
접시를 밀봉한 다음 하룻밤 사이에 4도에서 배양하십시오. 커버슬립에서 활성화를 시작하려면 먼저 PBS로 세척하고 몇 분 동안 건조하게하십시오. 다음으로, 150, 000 B 세포를 추가하고 다른 시간 점에 대해 37도에서 배양합니다.
두 경우 모두 구슬이나 항원 코팅 슬라이드로 활성화할 때 가장 긴 시간 지점부터 시작한 다음 더 짧은 슬라이드로 진행하는 것이 좋습니다. 건조한 커버슬립을 현미경 슬라이드에 장착하면 해결 요구 사항에 따라 상피 불피 또는 공초점 현미경을 사용하여 샘플을 볼 수 있습니다. 전송된 빛을 사용하여 샘플을 집중합니다.
셀과 구슬이 하나 비율에서 상호 작용하는 필드를 검색해야 합니다. 항원 커버립에서 활성화된 B 세포의 경우 100x 목표를 사용하여 더 나은 해상도를 확인하십시오. 매개 변수의 경우 전체 셀을 포함하는 z 스택을 복용하는 것이 좋습니다.
actin에 레이블을 지정하여 셀의 하부 및 위쪽 경계를 구분할 수 있습니다. 항원 코팅 구슬로 활성화된 B 세포의 경우 1점에 국한된 세포기관을 위해 라벨을 부착하고, 먼저 세포 영역과 비드 영역의 두 영역을 구분합니다. 다음으로 위치 또는 소기관을 한 지점별로 식별하고 현지화 좌표를 얻습니다.
세포 중심과 세포기관 사이에, 다른 벡터는 세포 중심과 비드 센터 사이에 하나씩 그립니다. 둘 다의 길이를 측정하고 이제 알파라고 하는 두 벡터 사이의 각도를 측정합니다. 알파의 과시안을 사용하여 중척추와 세포 센터 사이의 벡터로 투영한 다음, 투영된 벡터, a, b로 나누어 세포기관의 극성 지수를 계산한다.
따라서 0과 1 사이의 극성 지수는 편광 표현형을 나타냅니다. 0과 영하 사이의 값은 비편광 표현형을 나타냅니다. 리소좀과 같은 분산 소기관에 대한 극성 지수를 결정하기 위해 앞에서 언급한 것과 동일한 알고리즘을 사용하여 레이블의 질량 센터 좌표에 대한 소세포 국소화 좌표를 변경할 수 있으며, 이 경우 리소좀이 있다.
앞에서 설명한 분석과 마찬가지로 0과 1 사이의 극성 지수는 편광 표현형을 나타내고 0과 마이너스 사이의 값은 비편광 표현형을 나타냅니다. 새로운 시냅스로 밀접하게 모집된 각 소기관의 양을 정량화하기 위해 비드에서 소기관 형광의 백분율을 계산할 수 있습니다. 이를 위해 비드 및 세포 영역을 제한하고, 각각의 형광 강도를 측정한 다음 비드 와 세포 형광의 합에 의해 비드 형광을 분할해야 합니다.
새 시냅스와 접촉하는 각 소기관의 양을 얻을 수 있습니다. 또는 비드 반대방향으로 사각형을 그립니다. 세포 길이의 사분의 분기에 해당하는 중량을 사용한 다음 직사각형 내의 형광 강도를 측정하고 총 형광으로 나눕니다.
이 알고리즘은 항상 새로운 시냅스와 밀접하게 연관된 세포기관의 백분율을 얻으려면 인터페이스와 직접 접촉하는 것은 아닙니다. 휴식 및 활성화 된 B 셀에서 중구 관련 성분을 정량화합니다. 간단히 말해서, 우리는 세 가지 매개 변수를 결정합니다.
셀 및 비드 영역 및 중심 국소화 좌표. 다음으로, 우리는 중심을 둘러싼 원을 정의하고 이전에 정의된 중심의 중심에서 방사형 프로파일 분석을 실행합니다. 플롯이 있으면 최대 형광의 70%가 유지되는 반지름을 결정합니다.
이 반지름을 사용하여 중심을 둘러싼 원을 그립니다. 마지막으로, 중심면적 및 세포 영역에서 관심 성분의 형광 밀도를 얻고, 두 값을 나누어 형광 밀도 비율을 얻는다. 면역 시냅스 인터페이스에서 세포기관의 분포를 측정하기 위해 먼저 항원 코팅 커버슬립과 접촉하여 B 세포의 영역을 식별한다.
이 영역을 정의하는 데 도움이 되는 액틴에 레이블을 지정할 수 있습니다. 다음으로 슬라이드와 접촉하는 영역, 셀의 높이 및 너비를 측정합니다. 항원 코팅 커버 슬립을 향한 영역은 B 세포 활성화 시 확산되는 B 세포의 측정이다.
높이 및 너비 값을 사용하여 높이와 너비 값의 분기로 경계에서 구분되는 셀의 중앙 영역을 구분합니다. 일반적으로 이들은 총 세포 영역의 대략 1/3에 해당합니다. 마지막으로, 새로운 시냅스의 중심에서 세포원 모집을 계산하여 중앙 영역의 형광 밀도를 전체 세포의 형광 밀도로 나눈다.
이 인덱스의 양수 값은 새 시냅스의 중심에 있는 세포기관 농축을 나타냅니다. 반대로 음수 값은 주변 분포를 나타냅니다. 항원 코팅 커버립에 활성화된 B 세포의 z-평면을 가로지르는 세포기관의 분포를 측정하기 위해 먼저 시냅스 인터페이스와 세포의 상한을 구분한다.
다음으로 셀 중앙을 가로질러 선을 그리고 이미지를 다시 슬라이스하여 XZ 이미지를 얻습니다. 세포의 머리를 측정하고 면역 시냅스에서 세포의 상한에 이르기까지 동일한 영역의 10 분획으로 이미지를 분할합니다. 각 z-분획의 형광을 측정하고 각 z-분획에서 형광을 세포의 총 형광으로 나누어 형광의 백분율을 계산합니다.
마지막으로 z 분획당 형광 강도의 백분율을 플롯합니다. 분수 1과 2는 시냅스 인터페이스를 나타냅니다. 다음은 워크플로 또는 중등 격리 절차입니다.
조건당 2천만 B 세포를 사용하십시오. 중척추 분리를 용이하게 하기 위해 필요한 프로토콜에 따라 세포균 D 및 노코다졸로 세포를 사전 치료한다. 다음으로, TBS 버퍼의 5mL에서 다시 중단하여 셀을 감시한다.
8%의 자당으로 보충된 0.1x TBS 버퍼의 1mL을 사용하여 반복하십시오. 150 마이크로리터의 리시스 버퍼로 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 10, 000 g의 원심분리기는 섭씨 4도에서 10분 동안 사이토솔과 세포기관을 핵으로부터 분리합니다.
조심스럽게 세포 상류체를 복구하고 1.5 mL 튜브 위에 배치. 60%의 자크로로 보충된 300마이크로리터의 그라데이션 버퍼로 채웁니다. 원심분리기 는 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000g의 원심분리기 샘플을 채취한다.
이 원심 분리 단계는 중도체를 집중하는 것이 중요합니다. 원심 분리 후 인터페이스에 도달할 때까지 상체를 조심스럽게 제거합니다. 튜브에 남아 있는 샘플을 소용돌이.
0.45mL의 70%의 자당, 0.27mL의 50%의 자당, 그리고 그라데이션 완충에서 40%의 0.27mL를 오버레이하여 초원심분리기 튜브에 불연속 자당 그라데이션을 준비한다. 중구농축 샘플을 불연속 그라데이션에 놓고 각 어댑터의 각 샘플의 중량을 보정합니다. 40, 000g의 튜브를 섭씨 4도에서 1시간 동안 원심분리하고, 최소한의 가속력과 그라데이션을 어지러워하지 않도록 휴식 없이 튜브를 분리합니다.
원심 분리 후, 신중하게 동일한 볼륨12 분수를 수집합니다. 로딩 버퍼로 샘플을 다시 중단하고 SDS-PAGE를 실행합니다. 면역 시냅스의 형성 도중 B 세포에 있는 세포기관 분포를 공부하기 위하여는, 우리는 다른 시간 점에 대한 항원 코팅 구슬로 활성화된 2A1.6 B 세포를 이용했습니다.
대조군으로서, B 세포는 관련이 없는 BCR-리간드를 포함하는 구슬로 활성화되었다. 그런 다음 면역 형광 염색을 사용하여 다른 세포기관을 감지하여 고정 된 항원으로 활성화시 국소화를 변경합니다. 우리는 여기에 Rab6a로 표시된 알파 튜룰린과 골기 장치로 표시된 센트로솜을 보여줍니다.
그래프에서, 우리는 각 점이 하나의 세포를 나타내는 활성화의 각 시간 지점 은 중심 및 골기 장치 극성 verus에 대한 극성 인덱스를 표시합니다. 활성화 기간 동안, 우리는 이러한 소기관의 극성 지수가 1에 가까운 값에 도달한다는 것을 관찰할 수 있으며, 리소좀과 같은 분산 분포를 표시하는 IS.Organelles에 대한 모집증가도 극성 지수를 사용하여 정량화될 수 있음을 시사합니다. 활성화 시 리오소좀의 극성 지수가 더 긍정적인 값에 도달할 것으로 관찰할 수 있으며, 이는 IS모집에서 유래한 것입니다. 우리는 면역 시냅스를 향한 리소좀의 모집을 정량화하기 위한 보완적인 접근법을 보여줍니다.
항원 코팅 구슬과 동일한 의정서를 사용하여 IS에 대한 리소솜 모집은 비드 주변 또는 시냅스 영역 내에서 정의된 영역으로 모집된 리오좀의 형광 라벨을 정량화하여 계산되었다. 우리는 오픈 활성화를 관찰 할 수 있습니다. 시 냅 스의 사이트에 결합 된 리소좀의 증가가 있다.
여기서 우리는 특정 및 비특이적 항원 코팅 구슬로 활성화된 B 세포에서 중척추에 액틴의 정량화를 제시한다. 액틴 풀은 화살표로 표시됩니다. 이 경우 액틴과 같은 중구 관련 성분의 정량화는 각 점이 하나의 셀을 나타내는 점 플롯으로 나타낼 수 있습니다.
활성화 후, B 세포는 중척추경 주위의 액틴의 양이 감소한다. 이 단계는 새로운 시냅스로의 양극화를 허용하기 위해 페리핵 지역에서 중원을 분리하는 것이 중요합니다. 항원 코팅 표면에 활성화된 B 세포의 경우, 시냅스 멤브레인에 대한 세포기관의 모집뿐만 아니라 액틴 리모델링을 연구할 수 있다.
여기서는 각각 중앙 및 주변 분포를 표시하는 골기 장치 및 폐래 성 망상과 같은 세포기관의 분석을 보여줍니다. 또한, 우리는 활성화의 다른 시간 점 후 B 세포의 확산 영역을 계산할 수 있습니다. 이를 위해 XY 평면의 셀 제한을 정의할 수 있도록 액틴에 라벨을 부착합니다.
그래프에서 활성화 30 분 및 60 분 후에 셀 영역의 증가를 관찰 할 수 있습니다. 소기관의 분포는 또한 시냅스 인터페이스에 각각 XZ 평면에서 계산될 수 있다. 그래프는 처음 두 평면이 시냅스 인터페이스에 해당하는 z 평면에서 액틴 분포를 나타냅니다.
활성화 시 이 부위에 액틴이 풍부해지는 것을 관찰할 수 있습니다. 이미징 분석 외에도 생화학적 접근법은 B 세포 활성화 시 중구의 변화를 연구하는 데도 사용될 수 있습니다. 베이지 색 사각형으로 강조 표시된 센트로좀 함유 분획의 대표적인 서양 얼룩을 보여 드립니다.
센트로솜 분획은 불연속 자당 그라데이션에서 격리되고 감마-튜룰린 평준화에 의해 검출되었다. 아래 서쪽 얼룩은 활성화시 고갈되는 휴식 B 세포에서 센트루소 분획에서 actin 및 Arp2를 보여줍니다. B 림프구는 기능성 면역 시냅스를 형성하기 위해 멤브레인 인터페이스에서 동적 변화를 겪습니다.
이 과정은 이 비디오에서 여기에 설명된 이미징 및 생화학 적 기술에 의해 연구 될 수있다. 우리는 이 분석이 B 세포가 능동하게 활성화될 수 있는 방법에 관련되었던 분자 기계장치에 가치 정보를 제공할 수 있다는 것을 믿습니다.
