心臓病の研究は、多くの場合、げっ歯類などの小さな哺乳類で行われます。しかし、人間の心臓の生理学はげっ歯類の心臓の生理学とは大きく異なります。我々のプロトコルはヒトiPS細胞から分化した心筋細胞を用いて虚血性心疾患をモデル化し、虚血性心筋細胞の損傷および機能障害を定量化する。
このプロトコルは、個々の患者由来のiPS細胞を用いた個別の薬物スクリーニング、新鮮な培地の使用などでのiPS細胞の適切な取り扱い、および培地をゆっくりと時間的に変化させるため、機能的な心筋細胞への分化を成功させるためには重要である。ユン・リュウ、イン・リアン、孟興生王との手順をデモンストレーションすることは、研究室の博士課程の学生である陳王です。ヒトが多能性幹細胞分化を心臓細胞に誘導するには、まず96ウェル培養プレートのウェルを1ミリリットルのラミニン1ミリリットルでPBSにコーティングします。
摂氏37度で30分間のインキュベーションの後、各ウェルに10マイクロモルY27632を添加したIPS維持培地200マイクロリットルの4番目の幹細胞に10倍の10倍を見て、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。24時間後、スーパー手段をウェルあたり200マイクロリットルのIPS増殖培地に交換し、プレートを細胞培養インキュベーターにさらに2〜3日間戻します。細胞が70〜80%の合流に達すると。
各ウェルの培地を200マイクロリットルの事前温分化培地Aに交換し、プレートを細胞培養インキュベーターにさらに48時間戻します。インキュベーションの終わりにゆっくりと各ウェルの上澄み物を200マイクロリットルの事前温分化培地Bに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻した。2日後、上清をウェルあたり200マイクロリットルの予温心筋細胞維持培地に交換し、プレートを最大30日間細胞培養インキュベーターに戻します。
心筋細胞の収縮性を評価するには、粒子画像のvelocimetry画像jプラグインをインストールし、位相コントラスト顕微鏡とフォーク目的を使用して、約10秒間毎秒約20フレーム/秒で細胞のビデオ画像を記録します。次に、API を分析したビデオファイルを保存し、示されているフォルダ構造を作成します。細胞変位の離散的な2次元ベクトルフィールドを分析するには、VGを起動し、プラグイン、マクロを選択し、ベクトル分析を開くために編集します。
ijm をクリックし、実行をクリックすると、解析が自動的に実行されます。虚血処理の場合は、各ウェルの上澄み液をグルコースおよび血清なしで200マイクロリットルのdmemに置き換え、次に低酸素室にプレートを入れ、窒素ガスをチャンバーに注入し、内部酸素濃度を2%、二酸化炭素濃度を24時間5%に維持します。正常に分化した細胞は、顕微鏡下で観察された自発的な収縮を示し、培養井戸の50%は典型的には20日以内に自発的な収縮を示す。
心臓マーカータンパク質はまた、虚血性基からの細胞の分化の成功を確認するために使用することもできるが、MTTアッセイにおいて低い生存率を示し、かつノルモキシ性対照群のものよりも低い収縮性を示す。ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合は、虚血群においても高く、対照群よりも、細胞損傷の発生率が高いことを示す。心筋細胞の収縮性を比較できるように、キャプチャプレートの関心領域を正確に見つけることが重要です。
この技術は、患者由来のiPS細胞を用いて、薬物スクリーニングに使用することができる。また、虚血性心疾患の根底にあるメカニズムをさらに解明するためのユニークなプラットフォームを提供します。
