Kristen Brennand is a New York Stem Cell Foundation - Robertson Investigator. The Brennand Laboratory is supported by a Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 and the New York Stem Cell Foundation.

1. hiPSC分化神経前駆細胞へ<ol><li>大（ただし、サブコンフルエント）のコロニーが胚様体（EB）中間体を介して神経分化のための準備ができるまで、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層上で共培養（HES）メディア（ 表1）ヒト胚性幹細胞でhiPSCsを成長と拡大（ 図2）。ルーチンhiPSC培養条件は、他の場所16,17に記載されている。簡単に言うと、コラゲナーゼ（DMEM中に1mg / ml）で酵素的に通過その後、コンフルエントになるまでMEFフィーダー層上HES培地でhiPSCsを成長させ、約1拡大：7日ごとに3。 </li><li>ポリ-L-オルニチン/ラミニンを調製するためにプラスチック表面（ガラス面50グラム/ ml）のための滅菌水を10g / mlのポリ-L-オルニチンを有するプレート、被覆プレートをコーティングし、3-24時間、室温でインキュベートする。滅菌水で少なくとも一度洗った後、3-24時間、室温で滅菌PBSで5グラム/ mlのラミニンでコート。 注：プラスチックに包まれている場合、プレートが可能6ヶ月まで-20ºCのために保存。 </li><li> 1日目に、酵素的にDMEM / F12中に1mg / mlコラゲナーゼIVを使用して、プレートのような大きなコロニーから（例えば、マトリゲル上のTeSR 18として定義された培地中で成長、一般MEF上で成長し、またはhiPSCs）サブコンhiPSCsを持ち上げる。 注：37ºCでのインキュベーションの1-2時間後、コロニーが皿にフローティングされます。 </li><li>穏やかに2ミリリットル/ウェルのN2 / B27培地（ 表1）および非接着性6ウェルディッシュに移し（中に再懸濁1に3ウェルを組み合わせ、DMEM / F12に（遠心分離ではなく、沈降によって）1-2xをhiPSCコロニーを洗う型ウェル）19。 注：一晩、コロニーは「胚様体」（EBS）と呼ばれるフローティング球状のクラスターを形成することになる。かなりの細胞死を期待。 </li><li> 2日目に、プレートを傾けてEBを沈降させる。慎重にメディアを削除し、破片を除去するDMEM / F12で一回洗浄します。デュアルSMAD阻害剤（0.1M LDN193189と10M SB431542）12を補足したN2 / B27メディアにフィード</SUP&gt;。 </li><li>日3-7日、神経誘導は、デュアルSMAD阻害のコンテキストで発生します。 EBをラウンドしかし、嚢胞性ではないことを確認してください。 EBを0.1M LDN193189と10M SB431542を補足したN2 / B27メディアと一日おきにフィード。 </li><li>日7月14日、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたプレートにEBのメッ​​キに続いて、上の神経ロゼットは（apico-基底極性の神経上皮細胞のラウンドクラ​​スタとして特徴づけ、数日以内に出現し始めることを明視野顕微鏡を用いて確認してください。 図1）。 0.1M LDN193189、10M SB431542および1グラム/ mlのラミニンを補足したN2 / B27培地で一日おきに付着したEBを供給し続けます。 </li></ol>神経ロゼットの2収穫注：我々は、神経ロゼットが酵素的に神経ロゼットセレクション試薬20または類似の選択試薬を用いて回収することをお勧めします。神経ロゼットは、Th1、6ウェルポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングされたプレートに手動でピックアップすることができますがの方法は、さらに、NPCのために豊かにし、非神経細胞型を枯渇させるために、20日目でのピッキングの第二ラウンドを必要とすることが、ユーザのスキルに依存して、マスタに広範囲の訓練をとり、。 <ol><li> 14日目の神経ロゼットの酵素的選択のために、付着したEBから吸引メディアと6ウェルプレート用のウェルあたりの神経ロゼット選択試薬の1ミリリットルを追加します。 1時間37ºCでインキュベートする。 </li><li> P1000のピペットマンを使用すると、静かに各ウェルから酵素を除去。洗浄するためにウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルを追加します。 </li><li> P1000では、DMEM / F12の1ミリリットルを収集し、すぐにこのようにプレートからロゼットを取り外し、バックウェルにDMEM / F12を追放。ファルコンチューブにロゼットを収集します。 </li><li>ピペットDMEM / F12とすぐに別の1ミリリットルが残りロゼットを切り離すために、同じウェルに放出する。 （粉末化しないでください。ロゼット凝集体を分割しないようにしてください）​​。同じファルコンチューブに神経ロゼットを収集します。 </li><li>手順を繰り返し、必要に応じて2.4。ロゼットは、容易に切り離すていない場合は、MOを追加酵素を再し、プロセスを繰り返す（2.1〜2.4ステップ） </li><li> 3分間300×gで細胞をスピン。吸引しNPC培地（ 表1）2ml中の洗浄、および再懸濁ロゼット。転送細胞（1：1）、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングした6ウェルプレートに。 </li><li>日15-21からは、神経ロゼットが展開されます。 NPCメディアに一日おきにロゼットを養う。 </li><li>神経ロゼットの品質を評価し、平らな線維芽細胞様細胞が培養中で拡大されていないことを確認してください。 注：非ロゼットが解決しない場合は、NPCの文化は時々のAccutaseに拾っロゼットの唯一の最高の選択、手動ピッキングによって救済することができます。 37ºCで15分間解離する。ペレットを、24ウェルのポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆プレート上にNPC培地で洗浄し、プレート。 </li></ol>神経前駆細胞の3.拡張注：hiPSC NPCはマトリゲルまたはポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングしたプレートのいずれかで成長させることができる。当社は通常Matrigeを使用リットルプレートそれらはより迅速かつ低コストで製造することができる。 <ol><li>すぐに、マトリゲルでコーティングされたプレートを準備解凍し、24ミリリットルでマトリ1mgの凍結した一定分量を再懸濁冷たいDMEM / F12を、すぐに2つの6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを配布する。 37ºCで少なくとも1時間インキュベートする。 NOTE：マトリゲルを洗浄しないだけ吸引する必要がある、使用直前に。 </li><li>一日おきのNPCを養う非常に高い密度で維持するか、またはそれらが自然発生的にニューロンに分化する。 より確立されたNPCは、通常、1分割されているが：：注としてまれに1回と隔週2：毎週4を、非常に低い通路NPCは1を分割することができる。 </li><li> 、スプリット最初の吸引メディアと6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットル暖かいのAccutase（1X）を追加する。 10〜15分間37ºCでインキュベートする。 </li><li>静かにできるだけ機械的ストレスを含むDMEM / F12を含む15ミリリットルチューブに剥離した細胞を移す。酵素にいる間の細胞を滴定しないでください。 spinniによるペレット細胞5分間千×gでngの。 </li><li>吸引し、6ウェルのオリジナルのウェルあたり〜1ミリリットルNPC培地中での洗浄、および再懸濁のNPC。 注：6ウェルディッシュのコンフルエントよく5-10万個の細胞を有することを期待する。これは、従来の再メッキ血球計数器を用いて細胞10μlのアリコートを計数することによって確認することができる。 </li><li> NPCは、ニューロンまたはニューロスフェアとして再懸濁、再プレートのNPCに続いて。 NPCは、6ウェルプレートのウェル当たりプレート約100万〜200万細胞を維持するために。ニューロスフェア形成の効率は、実験および細胞株の間で変動するが、200,000から1,000,000細胞を非接着性6ウェルプレートのウェルに播種された場合、一般的に最高の​​発生ができる。ニューロスフェアの凝集が発生した場合、播種した細胞の数を減少させる。ニューロン培地でNPC培地を交換し、6ウェルプレートのウェルあたりのニューロンに分化する、プレート約200,000細胞。 </li><li>免疫組織化学的にすべての確立されたNPCラインを検証する。十分な細胞物質はEXPANれていたらネスチンおよびSOX2のための抗体とDED、ラベルのNPC。検証済みNPCラインも4〜6週間ニューロンに分化し、およびIIIチューブリンとMAP2ABための抗体で標識されるべきである。 <ol><li> 10分間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 PBS中1.0％トリトンで室温で15分間のNPCを透過性にし、次いで室温で30分間0.1％トリトン5％ロバ血清でブロックする。 </li><li> 4℃で一晩、0.1％トリトン5％ロバ血清中で一次抗体と共にインキュベートする。 注：私たちは、以下の抗体を推奨：ヤギ抗Sox2の、1：200。マウス抗ヒトネスチン、1：200。ウサギ抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗MAP2AB、1：200。 （ 図2）。 </li><li> RTで1〜2時間、0.1％トリトンで5％ロバ血清中で、300：PBSで洗浄した後、1でヤギ、マウスまたはウサギへの適切な結合二次抗体と二次抗体の細胞を培養する。を0.5μg/ mlのDAPI（4 &#39;、核染色細胞を可視化、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）、次いで、封入剤でマウントする。 </li></ol></li></ol> 4. NPC伝達<ol><li>トランスフェクトされた細胞21の割合を増加させるためにspinfection（1時間、1,000×gでのウイルスの存在下での細胞培養プレートの遠心分離）を使用する。 NPC培地で希釈感染の所望の多重度（MOI）の力価を測定培地を吸引し、関連する過剰発現（または制御）と交換してレンチウイルス（またはレトロウイルス）、（通常は1-10）、。 1.5ミリリットルを6ウェルプレートのウェル当たりの体積（または組織培養プレートの他のタイプの適切にスケーリングされたボリューム）を使用する。千×gでスピンとプレート遠心機で1時間37ºC。 注：理想的には、分割の1〜2日以内に、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターでのNPCを伝達する。商用または実験室で準備されたウイルスを使用しているかどうか、それが適切に連続希釈によって事前にウイルスのバッチを滴定するために役立ちます。 （ 図3）。 </li><li>セル画を低減するために、lular死、spinfectionの8時間以内にメディアを交換。 注：ウイルス統合および導入遺伝子の発現は、レポーター遺伝子蛍光によって24時間以内に検出可能であるべきである。 （ウイルスは蛍光レポーターを欠いている場合、これは評価するのがより困難であり、成功したトランスフェクションは最高の過剰発現製品のイムノブロット、免疫組織化学または定量PCRによって検証することができます。）全式は3〜7日かかる場合があります。追加のウイルスによる反復spinfectionsは、トランスフェクトされた細胞の割合を増加させるために必要とされ得る。再発spinfectionsは、毎日発生する可能性がありますが、そう頻繁である必要はありません。理想的には、蛍光レポーターを使用している場合、&gt; 80％の細胞が標識されるべきである。 </li></ol> 5.ニューロスフェア遊走アッセイ注：NPCの酵素的解離以下自発的にニューロスフェアの形、 - 細胞はNPC培地中の懸濁液中で培養される場合、（NPC拡張に使用されるものと同一の方法によっては3.3-3.6ステップ）。 <ol><li>簡単に言えば、解離する成長ニューロスフェアを生成するために非接着性のプレートで48時間NPC培地中のdのNPC。 （ 図4）。 </li><li>神経球の移行の場合は、96ウェルプレートに、むしろDMEMなく、ピッキングロスフェアの前に1〜2時間を冷たいNPCメディアを使用して新鮮なマトリプレートを準備します。井戸からマトリゲルを吸引しないでください。 </li><li>もともと胚性幹細胞由来のニューロスフェア22について公表したように、手動で細胞破片を除去するためにNPCのメディアで一度洗浄した後、顕微鏡下でNPC由来のニューロスフェアを選ぶ。マトリゲルコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに一つのニューロスフェアを転送する。 </li><li>各96ウェルプレートにロスフェアに、冷たいNPC培地で希釈さらに0.5 mgのマトリゲルを追加します。 </li><li>手動でもピペットチップを使用しての途中で、個々の神経球をセンタリング。 注：これは、結果のばらつきを低減するために、同様のサイズのニューロスフェアを選択することが重要である。 </li><li>移行が48時間に発生した後、ワット細胞を固定することを許可する目的の免疫組織化学的マーカーを有するi番目の4％パラホルムアルデヒドと汚れ。 </li><li>半径方向の移行は、それらが完全に4倍の顕微鏡対物レンズを使用して、写真のニューロスフェアを決定しようとする場合。ウェルのエッジまたは分析からの第神経球を接触させ、任意の神経球を除外します。 注：マイグレーションがより長い48時間発生した場合は、結果の放射状の移行は可能性が4倍対物レンズを用いた画像に大きすぎることになる。 </li><li> NIH ImageJソフトウェア（ 図5）を使用して、各神経球からの平均の移行を測定します。これは、以下に記載の分析方法のいずれかを使用して行うことができる。 <ol><li>ラジアル移行： <ol><li>手動で結果として得られる形状の面積を計算するために測定します（Ctrl + M）関数を使用するフリーハンド選択ツールを使用して最も遠い移動細胞のエッジをトレース。面積を測定する前にエリアは[分析 ]タブの下に設定し測定ウィンドウにチェックされていることを確認してください。使用してください面積測定、円（A =πR2）の面積についての式の値は、半径（外側）を決定する。 </li><li>オリジナルのニューロスフェアのエッジをトレース、面積を測定し、同じように半径（内側）を計算します。外側と内側の半径との差である総放射状の移行を計算します。 </li></ol></li><li>最大の細胞移動： <ol><li>測定します（Ctrl + M）関数に続く直線選択ツールを使用して内側の神経球の端から5遠いセルの移動距離を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

我々は、NPCのにhiPSCsを区別することによりメソッド、hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が保存された神経細胞の種類を記載しており、それは、潜在的に疾患の病因8に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができる11。私たちは詳細なてきたようにさらに、NPCは確実に複製し、簡単に私たちが病気の素因の分子および生化学的研究のために?...

我々 1ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からインビトロで分化したニューロンおよびその他2,3の遺伝子発現研究は、hiPSCニューロンは、胎児ではなく、成人の脳組織に似ていることを示している。現在では、hiPSCベースのモデルではなく後期の特徴、神経疾患より、素因の研究のため、より適切な場合があります。我々は以前のNPCは、統合失調症1に貢献する分子経路を研究するために有用な細胞型であり得ることを示している、統合失調症hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が、統合失調症のhiPSC由来神経前駆細胞（NPCの）に保存されていることを報告している。我々は、他の統合失調症hiPSCのNPC 1,4-6における酸化ストレスおよび活性酸素種、サブスレッショルド環境ストレスに対する感受性およびミトコンドリア機能障害の増加、ならびにニューロンcと減少し、異常な移行が報告されているonnectivityと統合失調症のhiPSCニューロン5,7-10におけるシナプス機能。統合失調症hiPSC NPCの中で異常な移動及び/または酸化ストレスに貢献する分子の要因も統合失調症hiPSC由来の神経細胞における減少し、ニューロンの接続性の根底にある場合は、NPCが疾患の原因のメカニズムを研究するために、堅牢性の高い複製神経細胞集団である可能性があります。一つは、急速に多数の細胞を生成することができるし、ニューロン成熟のために数週間または数ヶ月待つ必要がないので、さらに、NPCベースのアッセイは、より大きな患者コホートの研究に適しており、ハイスループットスクリーニングにより適している。我々はすでに統合失調症1およびハンチントン病11のように多様な疾患において実証されているようにhiPSCのNPCは、潜在的に疾患の病因に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができると信じている。 hiPSCs、の初期の神経からのNPCを区別するために生産は、デュアルSMAD阻害（0.1mMのLDN193189および10mMのSB431542）12によって達成される。これらの小分子とシグナリングBMPおよびTGF拮抗することにより、内胚葉および中胚葉の指定は、神経分化を促進し、めっきの一週間以内に目に見える神経ロゼットの形成をもたらす、遮断される。神経パターニングは、おそらく神経ロゼット形成の期間中とその直後に、早期にこのプロセスで発生します。他の手がかりがない場合には、これらの原始的な神経細胞は、前前脳のような運命13を想定しています。すぐにNPCの拡大を通じて、神経ロゼット形成以下、および継続的な、前脳NPCはFGF2 8,14と培養される。これらは、二重系統可能性を有し、70〜80％のIII-チューブリン陽性ニューロン及び20-30％グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） -陽性星状細胞（ 図1）の神経集団に分化させることができる。前脳のhiPSCニューロンの大半はVGLUT1陽性であるニューロンの約30％が、GAD67陽性（GABA作動性）であるが、したがって、おそらくグルタミン酸である8。 NPCは日常的に一貫性の分化プロファイルを維持し、核型異常を蓄積することなく、一方、in vitroで 10回以上継代する。グループが40倍以上15のNPCを継代報告している、しかし、私たちは10継代を超えて、NPCには、アストロサイト分化に増加傾向を示していることがわかります。 NPCは、複数の凍結融雪、よく耐え単に非接着プレートで培養することにより、ニューロスフェアとして成長に移行することができます。 NPCは、効率的に生化学的研究のために十分な材料を得るために急速な遺伝的摂動の分子·細胞影響の評価、および容易に拡張を可能にする、ウイルスベクターによって形質導入されている。ウイルスベクターの過剰発現及び/又は疾患関連遺伝子のノックダウン堅牢許すのでさらに、コントロールまたは患者のいずれかでneur由来らの細胞は、1つは、これらの操作上の遺伝的バックグラウンドの効果を試験するために、このプラットフォームを使用することができる。成熟した神経細胞を必要とするシナプスまたは活動に基づくアッセイに適していないが、NPCは、患者由来の神経細胞の多くの単純な分子または生化学分析のための実用的な代替手段かもしれません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1174">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:216px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:500px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#11330</td>
			<td>for HES media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10565</td>
			<td style="width:500px;">for neural media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">KO-Serum Replacement</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#10828</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Glutamax</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#35050</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">NEAA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#11140</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">2&#8208;mercaptoethanol (55mM 1000x)</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#21985-023</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">N2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#17502-048</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">B27-RA</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#12587-010</td>
			<td style="width:500px;">Needs to be lot tested</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">FGF2</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#13256-029</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">LDN193189</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0074</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">SB431542</td>
			<td style="width:171px;">Stemgent</td>
			<td style="width:216px;">#04-0010</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">BDNF</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">#450-02</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">GDNF&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Peprotech</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#450-10</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Dibutyryl cyclic-AMP</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#D0627</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in PBS + 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">L-ascorbic acid</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">#A0278</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend in H20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td>
			<td style="width:171px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">&#160;#05832</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Accutase</td>
			<td style="width:171px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:216px;">AT-104</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#17104019</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">CF1 mEFs</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">#PMEF-CF</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">P3655</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Laminin, Natural Mouse 1mg</td>
			<td style="width:171px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:216px;">#23017-015</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">BD Matrigel</td>
			<td style="width:171px;">BD</td>
			<td style="width:216px;">#354230</td>
			<td style="width:500px;">Resuspend on ice in cold DMEM at 10mg/ml, use 1mg per two 6-well plate equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Tissue culture treated 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3506</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultra low attachment 6-well plates</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:216px;">3471</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">goat anti-Sox2&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:216px;">sc&#173;17320</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-human Nestin</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:216px;">MAB5326</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">rabbit anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">PRB&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-&#946;III-tubulin</td>
			<td style="width:171px;">Covance</td>
			<td style="width:216px;">MMS&#173;435P</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">mouse anti-MAP2AB</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:216px;">M1406</td>
			<td style="width:500px;">use at 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Plate centrifuge</td>
			<td style="width:171px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:216px;">Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)</td>
			<td style="width:500px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to generating and using hipsc derived npcs for the study of neurological diseases

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long period of disease progression prior to the onset of symptoms. Because fibroblasts from patients and healthy controls can be efficiently reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and subsequently differentiated into neural progenitor cells (NPCs) and neurons for the study of these diseases, it is now possible to recapitulate the developmental events that occurred prior to symptom onset in patients. We present a method by which to efficiently differentiate hiPSCs into NPCs, which in addition to being capable of further differentiation into functional neurons, can also be robustly passaged, freeze-thawed or transitioned to grow as neurospheres, enabling rapid genetic screening to identify the molecular factors that impact cellular phenotypes including replication, migration, oxidative stress and/or apoptosis. Patient derived hiPSC NPCs are a unique platform, ideally suited for the empirical testing of the cellular or molecular consequences of manipulating gene expression.

ニューラルロゼットapico -基底極性の神経上皮細胞のラウンドのクラスターとしての特徴的な外観（ 図1）により、明視野顕微鏡を用いて、形態学的に同定することができる。 NPCは、非常に高い細胞密度で典型的に培養されても、すぐに継代の後、わずかに錐体状の細胞体と双極神経構造が見える（ 図1D）である。 IIIチューブリン染色はNPCの一部の割合が絶えず文化?...

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A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

18.1K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. This protocol describes how neural progenitor cells can be differentiated from human induced pluripotent stem cells, in order to yield a robust and replicative neural cell population, which may be used to identify the developmental pathways contributing to disease pathogenesis in many neurological disorders.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

手術標本の腫瘍外植片を用いて新規抗がん薬の開発のための方法


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

医学

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

Utilizing Transcranial Magnetic Stimulation to Study the Human Neuromuscular System

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade. While the use of TMS has expanded to the study of many systems and processes during this time, the original application and perhaps one of the most common uses of TMS involves studying the physiology, plasticity and function of the human neuromuscular system. Single pulse TMS applied to the motor cortex excites pyramidal neurons transsynaptically 2 (Figure 1) and results in a measurable electromyographic response that can be used to study and evaluate the integrity and excitability of the corticospinal tract in humans 3. Additionally, recent advances in magnetic stimulation now allows for partitioning of cortical versus spinal excitability 4,5. For example, paired-pulse TMS can be used to assess intracortical facilitatory and inhibitory properties by combining a conditioning stimulus and a test stimulus at different interstimulus intervals 3,4,6-8. In this video article we will demonstrate the methodological and technical aspects of these techniques. Specifically, we will demonstrate single-pulse and paired-pulse TMS techniques as applied to the flexor carpi radialis (FCR) muscle as well as the erector spinae (ES) musculature. Our laboratory studies the FCR muscle as it is of interest to our research on the effects of wrist-hand cast immobilization on reduced muscle performance6,9, and we study the ES muscles due to these muscles clinical relevance as it relates to low back pain8. With this stated, we should note that TMS has been used to study many muscles of the hand, arm and legs, and should iterate that our demonstrations in the FCR and ES muscle groups are only selected examples of TMS being used to study the human neuromuscular system.

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive tool to gain insight on the physiology and function of the human nervous system. Here, we present our TMS techniques to study cortical excitability of the upper limb and lumbar musculature.

人間の神経筋システムを研究するために経頭蓋磁気刺激の活用

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been in use for more than 20 years 1, and has grown exponentially in popularity over the past decade.  While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

正常および病的脳機能を研究するために脳深部刺激でSaccadometryを使用します

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to lessen the impact of debilitating conditions but remain elusive in many cases. Only by understanding the causes and pathology of diseases associated with aging, can scientists begin to identify potential therapeutic targets and develop strategies for intervention. The most common age-related conditions are neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease and blindness. Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of blindness in the elderly. Genome wide association studies have previously identified loci that are associated with increased susceptibility to this disease and identified two regions of interest: complement factor H (CFH) and the 10q26 locus, where the age-related maculopathy susceptibility 2 (ARMS2) and high-temperature requirement factor A1 (HtrA1) genes are located. CFH acts as a negative regulator of the alternative pathway (AP) of the complement system while HtrA1 is an extracellular serine protease. ARMS2 is located upstream of HtrA1 in the primate genome, although the gene is absent in mice. To study the effects of these genes, humanized knock-in mouse lines of Cfh and ARMS2, knockouts of Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 and HtrA4 as well as a conditional neural deletion of HtrA2 were generated. Of all the genetically engineered mice produced only mice lacking HtrA2, either systemically or in neural tissues, displayed clear phenotypes. In order to examine these mice thoroughly and systematically, an initial phenotyping schedule was established, consisting of a series of tests related to two main diseases of interest: AMD and Parkinson's. Genetically modified mice can be subjected to appropriate experiments to identify phenotypes that may be related to the associated diseases in humans. A phenotyping regimen with a mitochondrial focus is presented here alongside representative results from the tests of interest.

A reverse-genetics approach to understanding gene families associated with human disease is presented, using mouse as a model system, and the subsequent mouse phenotyping schedule is described. Because mice defective in a gene of interest, HtrA2, manifested Parkinsonian symptoms, the phenotyping regimen is focused on identifying neurological defects.

老化のヒトの疾患に関与する遺伝子を研究するために使用される遺伝子改変マウス用表現型レジメン

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Setting Up a Stroke Team Algorithm and Conducting Simulation-based Training in the Emergency Department - A Practical Guide

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can be&#160;achieved by either&#160;thrombolysis with recombinant tissue-plasminogen activator (rt-PA), the standard therapy for stroke patients who present within the first hours of symptom onset without contraindications, or by an endovascular approach, if a proximal brain vessel occlusion is detected. As the efficacy of both therapies declines over time, every minute saved along the way will improve the patient&#39;s outcome.
This critical situation requires thorough work and precise communication with the patient, the family and colleagues from different professions to acquire all relevant information and reach the right decision while carefully monitoring the patient. This is a high fidelity situation. In nonmedical high-fidelity environments such as aviation, Crew Resource Management (CRM) is used to enhance safety and team efficiency.
This guide shows how a Stroke Team algorithm, which is transferable to other hospital settings, was established and how regular simulation-based trainings were performed. It requires determination and endurance to maintain these time-consuming simulation trainings on a regular basis over the course of time. However, the resulting improvement of team spirit and excellent door-to-needle times will benefit both the patients and the work environment in any hospital.
A dedicated Stroke Team of 7 persons who are notified 24/7 by a collective call via speed dial and run a binding algorithm that takes approximately 20 min, was established. To train everybody involved in this algorithm, a simulation-based team training for all new Stroke Team members was conceived and conducted at monthly intervals. This led to a relevant and sustained reduction of the mean door-to-needle time to 25 min, and enhanced the feeling of stroke readiness especially in junior doctors and nurses.

Every min counts in acute stroke care. This guide shows how to establish a Stroke Team algorithm and enhance its performance with regular simulation training. The principles of Crew Resource Management (CRM) facilitate a straight workflow, reduce door-to-needle times and increase staff satisfaction.

ストロークチームアルゴリズムを設定し、救急部におけるシミュレーションベースのトレーニングを実施 - 実践ガイド

Time is of the essence when caring for an acute stroke patient. The ultimate goal is to restore blood flow to the ischemic brain. This can ...

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This compound is currently under investigation as a PET tracer for demyelination. We recently described a novel chemical reaction to produce metafluorinated pyridines consisting of direct fluorination of a pyridine N-oxide and the utilization of this reaction for the radiochemical synthesis of [18F]3F4AP. In this article, we demonstrate how to produce this tracer using an automated synthesizer and an in-house made flow hydrogenation reactor. We also show the standard quality control procedures performed before releasing the radiotracer for preclinical animal imaging studies. This semi-automated procedure may serve as the basis for future production of [18F]3F4AP for clinical studies.

Automated Radiochemical Synthesis of [18F]3F4AP: A Novel PET Tracer for Imaging Demyelinating Diseases

We demonstrate the semi-automated radiochemical synthesis of [18F]3F4AP and quality control procedures.

[<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP：脱髄疾患イメージングのための新規PETトレーサ

3-[18F]fluoro-4-aminopyridine, [18F]3F4AP, is a radiofluorinated analog of the FDA-approved drug for multiple sclerosis 4-aminopyridine (4AP). This ...

Using Retinal Imaging to Study Dementia

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central nervous system (CNS) and shares prominent similarities with the brain in terms of embryological origin, anatomical features and physiological properties.&#160; The vascular and neuronal structure in the retina can now be visualized easily and non-invasively using retinal imaging techniques, including fundus photography and optical coherence tomography (OCT), and quantified semi-automatically using computer-assisted analysis programs. Studying the associations between vascular and neuronal changes in the retina and dementia could improve our understanding of dementia and, potentially, aid in diagnosis and risk assessment.&#160; This protocol aims to describe a method of quantifying and analyzing retinal vasculature and neuronal structure, which are potentially associated with dementia. This protocol also provides examples of retinal changes in subjects with dementia, and discusses technical issues and current limitations of retinal imaging.

The retina shares prominent similarities with the brain and thus represents a unique window to study vasculature and neuronal structure in the brain non-invasively. This protocol describes a method to study dementia using retinal imaging techniques. This method can potentially aid in diagnosis and risk assessment of dementia.

眼底イメージングを使用して認知症を研究するには

The retina offers a unique &#8220;window&#8221; to study pathophysiological processes of dementia in the brain, as it is an extension of the central ...