このプロトコルを、心筋細胞活動に対する異なる光遺伝学アクチュエーターの生物物理学的効果として使用して、心臓組織および心臓全体における光遺伝学的実験の開発を支援するために試験することができる。パッチクランプ技術とサルコメアトラッキングと炭素繊維支援力測定を組み合わせることで、心室心筋細胞の電気および力学に対するGtACR1光活性化の効果を研究することができます。光遺伝学的阻害は、光除細動に使用される可能性がある。
GtACR1は、心臓活動のサイレンシングを可能にする光遺伝学的ツールです。この技術は、滑らかな、単細胞筋細胞研究などの他の研究分野に完全に適用されます。このプロトコルは高スループットスクリーニングには使用できませんが、心筋細胞の電気的および機械的機能を包括的に分析する手段となります。
だから、ことわざにあるように、写真は千以上の言葉を言います。ビデオでどれだけ多くの情報を得ることができるでしょうか?単一の筋細胞のストレッチやプローブの準備に関わるツールやテクニックの中には非常に複雑なものがあり、説明に比べてビデオで伝える方がはるかに簡単です。
生後9~10週齢のニュージーランドの白いウサギから生理食い物の心臓から血液を洗い流した後、パーフューザスを低カルシウム、高カリウム溶液に切り替え、心臓が鼓動を止めてからさらに2分間心臓を穿ファフーします。酵素溶液を浸透させ、酵素溶液を2分間消化した後にリ循環してリブルした後、5分間消化した後、1分間に16ミリリットルの速度を下げる。消化の40〜50分後に組織が柔らかく見えたら、カニューレから心臓を切断し、すぐに心臓をブロッキング溶液に入れます。
組織が完全に覆われるまでブロッキング溶液を追加します。右心室と中隔を切り取り、左心室を分離します。乳頭筋を取り除き、細かい鉗子とピペットを使用して組織を穏やかに引き離し、機械的解離によって細胞を放出します。
1ミリメートル平方の細孔でメッシュを通して細胞懸濁液をろ過し、遠心分離によって細胞を沈める。次いで、新鮮なブロッキング溶液中の心筋細胞ペレットを再懸濁する。パッチクランプ実験では、細胞培養の直前にラミニン1ミリリットルあたり100マイクログラムのペトリ皿にオートクレーブカバーリップをコーティングします。
炭素繊維実験では、95~5個のエタノールから水への溶液で、ポリHEMAのミリリットル当たり0.12グラムのペトリ皿をコーティングします。心筋細胞を再懸濁してから10~15分後、上清を取り除き、培地中の細胞を再懸濁する。カウント後、ペトリ皿のカバースリップに細胞を1ミリリットル当たり4個の細胞に1.75倍の10倍の目標密度で播種します。
37°Cと5%の二酸化炭素で3〜4時間培養します。インキュベーションの終わりに、75の感染の多重度でGtACR1-eGFP用のアデノウイルスタイプ5コードを含む新鮮な培地とカバースリップ培養からの培地を交換する。培養物を48時間培養器に戻します。
パッチクランプ実験を行う場合は、マイクロピペットプーラーを使用して、ソーダライムガラスの毛細血管から1.7~2.5メガオームパッチピペットを引き出し、データ取得ソフトウェアを初期化します。細胞を含むカバースリップを外部溶液を含む測定チャンバーに入れ、そのeGFP蛍光に基づいて心筋細胞を選択します。次に、パッチピペットに内部溶液を充填し、ピペットをピペットホルダーに取り付け、塩化銀被覆銀記録ワイヤーを内部溶液に挿入します。
ゼロミリボルトのベースラインで15ミリ秒間10ミリボルトパルスを適用するように膜試験を設定します。セルに接続された構成に到達した後、データ収集ソフトウェアでマイナス60ミリボルトの保持電位を持つセル全体モードに切り替えます。次に、膜を破裂させることで細胞全体の構成にアクセスするために、穏やかに負圧を加えます。
破裂が成功すると、測定された静電容量の即時増加によって証明されます。光パルスが300ミリ秒のマイナス74ミリボルトで、またはゼロピコインで現在のクランプモードでアクション電位を持つ電圧クランプモードで光活性化プロトコルを記録します。炭素繊維を製造するには、まずピペットをプーラーのピペットホルダーに取り付けます。
ガラスの毛細血管を2つのピペットに引き込み、総テーパー長は約11ミリメートル、最終内径は約30マイクロメートルです。次に、ステレオ顕微鏡を使用して、配向円の1つの毛細管を整列させ、ベンダーでキャピラリーの先端を押し下げて最大45度曲げます。ベンダーを取り外した後も、毛細管が45度の角度を維持するまでフィラメントを加熱します。
毛細管を曲げた後、柔らかいチューブを装備した細かい鉗子を使用して、チューブから1つの炭素繊維を取り出し、毛細血管の細かい先端に収めます。毛細血管の繊維を曲げまで押し上げましょう。炭素繊維を切って毛細血管の先端から2ミリリットルを投影し、シアノアクリル酸接着剤を使用して各毛細管の前部に繊維を固定します。
繊維を校正するには、マイクロマニピュレーターとピエゾモーターで制御されるホルダーに1本のキャピラリーを取り付けます。キャピラリーをセンサーの方向に移動し、センサーに対して位置合わせします。力を生じさせることなく、力センサーに接触する繊維の先端を置きます。
ピエゾモーターの総移動は60マイクロメートルです。圧電計を6つの10マイクロメートルのステップで力センサーに向かって動かします。センサーは、電圧当たり0.05ミリニュートンの感度と0〜0.5ミリニュートンの力範囲を有する。
各ステップの測定電圧を読み出し、センサーから炭素繊維を取り除きます。心筋細胞を収縮させる力を記録するには、カバーグラスの表面をPoly-HEMAでコーティングし、測定室に置きます。外湯溶液でチャンバーを充填します。
両方の炭素繊維を装填した毛細血管をステージマイクロマニピュレータに取り付け、炭素繊維が測定室の表面に水平になるように角度で位置合わせします。繊維が正しく揃っているかどうかを確認するには、測定室の表面に焦点を合わせ、最初のファイバーを下げ、繊維を水平に動かします。繊維の先端は測定室の表面に滑っているべきである。
2 番目のファイバーでも同じ手順を実行します。ライトを消した後、培養細胞懸濁液を数滴チャンバーに加え、短い緑色の光パルスを適用して、緑色光刺激に応答して収縮する細胞を選択します。最初の繊維を取り付けるには、繊維を下げて細胞を静かに圧縮し、圧力を解放します。
2つの繊維間のサルコメアの最大数を有するために、心筋細胞のもう一方の端にある第2の繊維に平行に第2の繊維を取り付ける。両方の繊維が取り付けられた後、セルがチャンバー表面に接触しなくなるように繊維を持ち上げます。サルコメアを焦点に持ち込み、繊維間のサルコメア長さの追跡ウィンドウを設定し、エッジ検出モジュールを使用してファイバー曲げを追跡します。
赤と緑のウィンドウで検出領域を設定し、光強度トレースの最初の導関数でしきい値を定義します。サルコメアの長さと繊維曲げを追跡しながら、光学的に細胞をペースします。この場合、私たちは0.25ヘルツでペースを上げました。
少なくとも15の光学的に引き出された収縮を記録した後、フィールドは、細胞を電気的に刺激する。収縮を引き出すしきい値を見つけ、電気ペーシングのしきい値電圧の1.5倍を適用します。阻害プロトコルの場合、電気刺激を適用して収縮を引き出し、様々な光強度でセルを持続光パルスにさらす。
光誘発阻害後に少なくとも15の収縮を記録する。GtACR1は、培養ウサギ心筋細胞で発現する。300ミリ秒の光強度でのGtACR1光活性化は、測定されたピーク電流245ピコアアンペアでマイナス74ミリボルトで、内向きの大電流を生じます。
この代表的な実験では、アクション電位は、電流注入で1.5倍の閾値を持つか、光パルス10ミリ秒で光学的にトリガされた。光学的にペースの速い心筋細胞は、より遅い作用電位発症を示した。電気的に誘発された作用電位は、持続光下で阻害された。
より高い電流注入および持続光適用の間の1.5倍の閾値はまた、作用電位を引き出さない。心筋細胞は、電気ペーシング時に232マイクロニュートン/ミリメートルの収縮力を生成し、光ペーシングに続いて1ミリメートルあたり261マイクロニュートンを261マイクロニュートン生成した。長引く緑色光パルスは、ウサギ心筋細胞からの拡張期カルシウム損失に合わせて収縮力を低下させる抑制後の再発収縮で収縮を阻害した。
特に暗闇の中でマイクロプローブを配置することは困難な場合があるため、実験を行う前にこの技術を練習することをお勧めします。それは力の生産と緩和に影響を与えることができる心筋細胞の収縮を分析する際に非常に重要です。等張および園筋収縮解析には、さまざまな後荷重を適用することもできます。
これらの技術は、各実験に最も適した光遺伝学的ツールを選択するために重要である心筋細胞における新たに開発された光遺伝学的アクチュエータを活性化することの生物物理学的効果の特徴付けを可能にする。アデノウイルスのトランスダクションと、その後の全てのステップは、バイオセーフティレベルIIの条件下で行う必要がありますのでご注意ください。
