Questo protocollo utilizza tre approcci per determinare se il fumo di sigaretta influisce sulla carica batterica pseudomonas nelle cellule epiteliali polmonari. Questo metodo può essere espanso in celle endoteliali o altri rubinetti cellulari. La preparazione dell'estrazione del fumo di sigaretta, l'infezione batterica e la determinazione con una carica batterica sono ben descritte in dettaglio in questo video.
Questa procedura è molto facile da seguire per i nuovi utenti. Disegnare 10 millilitri di mezzo di coltura cellulare privo di siero in una siringa da 60 millilitri. Attaccare l'estremità stretta di un rivestimento a una punta della pipetta millilitro all'ugello della siringa, come adattatore per tenere la sigaretta.
Rimuovere il filtro dalla sigaretta e attaccare la sigaretta all'adattatore. Non più di 30 minuti prima di eseguire il saggio bruciano la sigaretta e disegnano 40 millilitri di fumo contenenti aria nella siringa. Mescolare il fumo con il mezzo scuotendo vigorosamente la siringa.
Ripeti il processo di disegno fino a quando la sigaretta non viene completamente bruciata, il che richiederà circa 11 estrazioni in circa sette minuti. Per rimuovere microrganismi e particelle insolubili dal mezzo, filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micron. Quindi, trasferire il mezzo in un tubo sterile chiuso.
Inoculare un brodo di soia triptico o una piastra di coclea TSB con un ceppo di pseudomonas selezionato. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Preparare un tubo contenente 20 millilitri di TSB con il 5% di glicerolo come fonte di carbonio.
Raccogliere uno striscio dalla piastra della coclea e inoculare il TSB. Incubare la sospensione pseudomonas in uno shaker di 37 gradi Celsius a 200 RPM, per circa un'ora, fino a quando la densità ottica a 600 nanometri è 0,6. Dopo aver coltivato le cellule epiteliali polmonari come descritto nel manoscritto, aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside alle cellule.
Dopo circa cinque minuti, quando le celle si sono completamente staccate dal fondo della piastra, aggiungere 10 millilitri di mezzo Heights completo per neutralizzare la tripina. Trasferire le celle in un tubo da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le cellule per cinque minuti a quattro gradi Celsius e 300 volte G.Rimuovere e scartare il supernatante.
Quindi, sospendere di nuovo le celle in millilitri di heights medium con 10%FBS. Pipetta 10 microlitri della sospensione cellulare epiteliale su una nuova piastra. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per ottenere la concentrazione cellulare.
Placcare le cellule epiteliali polmonari ad una concentrazione di tre volte 10 alla quinta cellule per millilitro, in un volume totale di due millilitri di mezzo per pozzo. Incubare i piatti durante la notte. Quando le celle raggiungono circa l'80% di confluenza, sostituire il mezzo con il mezzo Heights, più 1%FBS.
Quindi, aggiungere il 4%CSE ai pozzi e incubare le piastre per tre ore. Aggiungere una pseudomonas ad ogni pozzo di cellule epiteliali polmonari trattate con CSE. Quindi, incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Successivamente, sostituire il mezzo nelle sei piastre del pozzo con due millilitri di mezzo heights fresco, contenente 4%CSE e 100 microgrammi per millilitro di gentamicina. Dopo aver incubato le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%, aspirare il mezzo dai pozzi. Lavare le cellule trattate con gentamicina, due volte, con due millilitri di PBS freddo.
Il carico batterico nelle cellule epiteliali polmonari può quindi essere rilevato con il metodo della piastra di caduta, qRT-PCR o citometria del flusso. Aggiungere un millilitro di tampone dilisi cellulare ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari. Riparare le diluizioni seriali del lysate cellulare, che vanno da uno a 10 a uno a 10.000.
Quindi inoculare la piastra della coclea TSB. Dopo 16 ore di incubazione, determinare quante unità di formazione della colonia erano presenti nelle cellule epiteliali polmonari, contando il numero di colonie batteriche. Aggiungere 0,35 millilitri del tampone di tiocianato di guanidinio ad ogni pozzo delle cellule epiteliali polmonari.
Raccogliere le celle con un raschietto per celle. Pipettare il lysate in un tubo di micro-centrifuga e mescolare delicatamente con la pipetta. Aggiungere 0,35 millilitri di etanolo appena preparato al 70% di etanolo per il lysate e mescolare bene.
Trasferire tutti i campioni in una colonna di rotazione posizionata in un tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga il tubo di raccolta per 30 secondi a 10.000 volte G e da 20 a 25 gradi Celsius. Scartare il tampone nel tubo di raccolta e lavare la colonna con 0,7 millilitri di tampone di lavaggio.
Centrifugare la colonna a 10.000 volte G per 30 secondi. Lavare la colonna due volte con 0,5 millilitri di tampone. Ripetere la centrifugazione a 10.000 volte G per due minuti.
Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere da 30 a 50 microlitri di acqua priva di RNasi. Dopo aver centrifugato il tubo a 10.000 volte G per un minuto, raccogliere il flusso attraverso e misurare la concentrazione di RNA. Per prepararsi a una reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri rende un microgrammo di RNA totale con 10 microlitri di buffer di reazione, un microlitro di transcriptasi inversa e acqua priva di RNasi.
Condurre la reazione di trascrizione inversa a 37 gradi Celsius per un'ora e poi a 95 gradi Celsius per cinque minuti, secondo il protocollo del produttore. Quindi mescolare un microlitro di ogni campione di cDNA con cinque microlitri del mix master contenente colorante cibernetico e un microlitro di ogni primer specifico nanomolare 200. Aggiungere acqua per un volume totale di 20 microlitri.
Eseguire l'analisi PCR, in base alle raccomandazioni del produttore. E poi usare il metodo CT comparativo per determinare l'espressione. Nelle cellule BEAS-2B, la vitalità non è aumentata considerevolmente quando le cellule sono state trattate con il 4%CSE per tre ore.
Un'ora come infezione da pseudomonas inoltre non ha influenzato sostanzialmente la vitalità. Infine, usano la gentamicina per uccidere gli pseudomoni nel mezzo di coltura non hanno avuto un effetto statisticamente significativo sulla vitalità cellulare. Come misurato con il metodo della piastra di caduta, l'infezione batterica nelle cellule BEAS-2B è stata notevolmente aumentata dal trattamento con CSE.
Lo stesso valeva per il trattamento CSE dell'HSAEC. L'infezione batterica delle cellule BEAS-2B trattate con CSE è stata valutata anche utilizzando RT-PCR per quantificare la quantità di 16S rRNA presente, che indicava un aumento di Pseudomonas aeruginosa. Le cellule BEAS-2B trattate con CSE e infettate da Pseudomonas fluorescens Migula sono state analizzate dalla citometria a flusso a 509 nanometri.
Il risultato ha anche indicato che il trattamento CSE aumenta l'infezione batterica. I risultati della microscopia fluorescente hanno mostrato che i batteri etichettati GFP co-localizzati con cellule BEAS-2B in un esperimento di infezione da Pseudomonas fluorescens Migula. Le cellule potrebbero essere esposte al fumo di sigaretta con robot che fumano, il che può imitare il comportamento umano e consentire di studiare direttamente gli effetti del fumo di sigaretta sulle cellule epiteliali polmonari.
Questa tecnica potrebbe essere utilizzata per esplorare un fumo di sigaretta su altri rubinetti cellulari nel contesto di un'infezione polmonare. L'approccio descritto è la base per lo sviluppo di terapie efficaci contro una lesione polmonare dorsale fumante di sigarette e c0PD extra
