Name: preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses
Uploaded: 2020-05-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) и K23DC014517 (Johnson, PI) от Национального института глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения.

Это исследование было проведено в соответствии с Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинской школы Нью-Йоркского университета.
1. Рассечение гортани крысы
<ol><li>Усыпляйте крыс в соответствии с институционально утвержденным проток?...

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

Подготовка голосовых складок крыс к нервно-мышечному анализу может столкнуться с различными проблемами. Мало того, что гортанные мышцы малы и окружены хрящом, что затрудняет непосредственное извлечение мышц-мишеней, высокая изменчивость также была обнаружена между животными в глубин...

Крысиная гортань является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для исследования структурных и функциональных нервно-мышечных адаптаций гортани к развитию, старению, болезням и фармакологическим агентам1,2,3,4,5. Согласованность гистологических методов имеет решающее значение для этого направления работы, поскольку существует множество тонкостей, связанных с подготовкой и анализом мышц, а также проблемы, связанные с размером гортани, формой и топографией мышц, инкапсулированных в гортанных хрящах1,6,7,8,9,10,11 . Из-за небольшого размера внутренних мышц гортани крыс систематическое встраивание, замораживание и криосечение имеют решающее значение для достижения последовательных и точных результатов. Например, при разрезании голосовой складки крысы в корональной плоскости нервно-мышечные соединения (NMJ) четырех внутренних мышц гортани расположены в пределах менее 1,8 мм глубины ткани11. Поэтому точный мониторинг анатомии гортанных мышц во время криосекции необходим для точного определения интересующего участка (участков) и предотвращения чрезмерного разреза ткани. Чрезмерное вырезание целевой мышцы может привести к неточной идентификации числа и топографии NMJs11 или может привести к общему уменьшению размера выборки, если целевая мышца отброшена из-за путаницы ориентации ориентира12. По мере разработки новых моделей для изучения мышц гортани и их соответствующих адаптаций стандартные операционные процедуры необходимы для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости результатов во всех исследованиях.
Целью данной статьи является детальная подготовка голосовой складки крысы к оптимальному продольному и поперечному анализу. Описаны подробные методы, регулярно используемые в нашей лаборатории для выявления целевых мышечных ориентиров во время криосекции. Хотя подобные методы используются в нескольких лабораториях, здесь приводится более подробная информация, чем в литературе, чтобы обеспечить надежную и точную репликацию при внедрении начинающими исследователями. Целью этого учебника является предоставление стандартной методологии иммуногистохимической (IHC) оценки голосовой складки крыс для улучшения согласованности в лабораториях и исследованиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Целью этого урока является описание подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. В этом протоколе описываются процедуры рассечения гортани крыс, мгновенного замораживания и криосекции голосовых складок. В этом исследовании описывается, как проводить криосекцию голосовых складок как в продольной, так и в поперечной плоскостях. Новинкой этого протокола является отслеживание гортани во время криосекции, что обеспечивает точную идентификацию внутренних мышц гортани и снижает вероятность потери тканей. Рисунки демонстрируют прогрессивную криосечение в обеих плоскостях. Двадцать девять крысиных геми-ларингов были криосекциированы и отслежены от появления щитовидного хряща до появления первой секции, которая включала полную голосовую складку. Полная голосовая складка была визуализирована для всех животных в обоих плоскостях. Отмечалась высокая вариабельность расстояния от появления щитовидного хряща до появления полной голосовой складки в обеих плоскостях. Вес не коррелировал с глубиной гортанных ориентиров, предполагая, что индивидуальная изменчивость и другие факторы, связанные с подготовкой тканей, могут быть ответственны за высокую изменчивость внешнего вида ориентиров во время секционирования. Это исследование детализирует методологию и представляет морфологические данные для подготовки голосовой складки крысы к гистохимическому нервно-мышечному исследованию. Из-за высокой индивидуальной вариабельности ориентиры гортани должны тщательно отслеживаться во время криосекции, чтобы предотвратить пересечение ткани и потерю тканей. Использование последовательной методологии, включая адекватную подготовку тканей и осведомленность о ориентирах в гортани крысы, поможет получить последовательные результаты во всех исследованиях и поможет новым исследователям, заинтересованным в использовании голосовой складки крысы в качестве модели для изучения нервно-мышечных механизмов гортани.

Репрезентативные результаты были частью продолжающегося исследования влияния вокальных упражнений на нервно-мышечную систему гортани. Двадцать девять самцов крыс Fischer 344/brown Norway (12 9-месячных, 17 24-месячных) были взвешены и усыплены с вдыханием CO2 с последующей двусторонней торакот...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Этот протокол описывает методы, используемые для подготовки голосовых складок крыс к гистохимическому нервно-мышечному исследованию.

Подготовка голосовой складки крысы к нервно-мышечному анализу

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Морфометрические анализы сетчатки Разделы

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Рассечение мышц Transversus Abdominis для анализа нервно-мышечной развязки

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Почему Количественное вопросы: Определение характеристик фенотипов на<em&gt; Drosophila</em&gt; Личиночная нейромышечных синапсах

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Измерение функции нервно-Джанкшен

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Карликовые и Омега сложности анализа отдыха государство электроэнцефалография

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Поднимающей Auris Лонг Подготовка для изучения млекопитающих нервно-мышечной передачи условиях напряжение зажим

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Коллекция замороженных регионов мозга грызунов для анализа вниз по течению

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

Рассечение волокон одиночных скелетных мышц для иммунофлуоресцентного и морфометрического анализа цельномышечных соединений

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Рассечение и иммуногистохимия ноги дрозофилы для обнаружения изменений в нервно-мышечном соединении для идентифицированного двигательного нейрона

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...