Используя наш протокол, мы можем визуализировать и количественно оценить динамику передачи сигналов эндосом и митохондрий в аксонах от моторных и сенсорных нейронов живых обезболенных мышей. Это метод, который может быть использован для понимания базальной физиологии аксонов in vivo и выявления важного патомеханического механизма, приводящего к периферической нейродегенерации в мышиной модели заболевания. Наш метод может быть использован для оценки влияния потенциальных методов лечения, таких как фармакологические агенты и генная терапия, на аксональный транспорт в живых моторных и сенсорных нейронах.
Этот метод может быть использован для одновременного изображения различных органелл в определенном аксоне периферического нерва и ретрансляции изучения моделей двигательных заболеваний, а также старения. Начните подготовку с вытягивания градуированной стеклянной микропипетки для оптимальных внутримышечных инъекций в более мелкие мышцы. Для операции закрепите стерильную хирургическую драпировку на тепловом коврике, установленном на 37 градусов цельсия, и поместите и сфокусируйте операционный микроскоп.
Затем распакуйте все необходимые хирургические инструменты и инструменты, как описано в рукописи. Когда подготовка будет завершена, перенесите обезболенную мышь в мундштук, расположенный в отдельной области хирургического пространства, и убедитесь, что рефлексы снятия роговицы и педали отсутствуют, прежде чем сбривать мех с хирургической области. Затем удалите бритый мех с мыши с помощью липкой стороны хирургической ленты.
Затем поместите мышь на весы, чтобы записать предоперационный вес. Затем используйте ватный тампон, чтобы нанести смазку для глаз и перенести мышь и мундштук в хирургическую область. Чтобы ввести переднюю мышцу большеберцовой кости, поместите мышь на спину и вытяните заднюю конечность на 10 градусов от средней линии.
Когда задняя конечность находится в правильном положении, поместите хирургическую ленту поперек стопы. Стерилизуйте бритую область, используя 70% этанол или эквивалентный раствор. Нарисуйте рабочий атоксичный фрагмент столбняка, нейротоксина или раствора HcT в вытянутую стеклянную микропипетку.
Далее сделайте небольшой разрез над интересующей мышцей в той области, которая соответствует моторной и пластинчатой областям. Тогда. проткните внешнюю фасцию на мышце, чтобы ввести HcT. Оставьте микропипетку в положении в течение пяти-10 секунд, прежде чем медленно отойти.
После инъекции закройте разрезы одним-двумя швами. Затем переведите мышь в изолированную восстановительную клетку под наблюдением в течение 30 минут. Приготовьтесь обнажить седалищный нерв, расположив хирургические инструменты и инструменты вокруг хирургической области.
Создайте клин, разрезав парапленку на узкий прямоугольник шириной один сантиметр с угловым наконечником, чтобы облегчить процесс визуализации. После того, как подготовка будет завершена, перенесите мышь на мундштук в хирургической области и используйте хирургическую ленту, чтобы закрепить голову на мундштуке. Вытяните и закрепите прицельную заднюю конечность под углом 45 градусов от средней линии хирургическим скотчем.
Если рефлексы отмены роговицы и педали отсутствуют, ножницами разрезают кожу, покрывающую седалищный нерв. Затем удаляют вышележащие бицепсы бедра мышцы и мускулатуру или соединительную ткань, не повреждая седалищный нерв и кровеносные сосуды. Когда неповрежденный седалищный нерв достаточно обнажен, нанесите предварительно подогретый стерильный физиологический раствор на область вокруг седалищного нерва, чтобы предотвратить высыхание.
Затем используйте изогнутые щипцы, чтобы разрушить глубоко лежащую соединительную ткань и поместить предварительно подготовленный клин парапленки под нерв. Поместите пропитанную физиологическим раствором вату на открытую область, прежде чем переместить мышь поверх теплового коврика в индукционную камеру, заполненную изофлураном и кислородом. Для получения изображения поместите покровное стекло размером 22 на 64 миллиметра на настроенную ступень микроскопа и закрепите положение покровного стекла с помощью ленты.
После нанесения погружного масла на объектив подключите ступень микроскопа к перевернутому микроскопу и медленно поднимите погруженный в масло объектив, чтобы соприкоснуться с покровным стеклом. Когда установка будет готова, закрепите мундштук анестетика на сцене микроскопа с помощью ленты. Затем извлеките вату из седалищного нерва и перенесите мышь из индукционной камеры в мундштук с открытым нервом, обращенным к покровному стеклу.
Прикрепите голову мыши к мундштуку и, поддерживая самый низкий адекватный уровень анестезии, осторожно поднимите мышь за хвост, чтобы добавить стерильный физиологический раствор к покровному скольжению вблизи открытого седалищного нерва. С помощью глаз найдите седалищный нерв, чтобы определить оптимальную фокусную точку и выбрать интересующую область, содержащую подвижные аксональные органеллы. Затем переключитесь на компьютерное программное обеспечение, нажав кнопку «Приобретение» и выбрав интересующую область.
Используйте цифровое масштабирование для получения 80-кратного увеличения и поворота выделенной области для визуализации аксонов по горизонтали Щелкните поле Области и выберите интересующую прямоугольную область. В режиме получения установите размер кадра не менее 1024 x 1024 пикселей и начните покадровое получение от 100 до 1000 кадров. Захватите не менее 10 подвижных грузов с трех аксонов на мышь.
В исследовании маркировка in vivo моторных аксон-спецификаций была достигнута с использованием трансгенных мышей. Усиленный белок зеленого цветения, или экспрессия eGFP, в холинергических моторных аксонах наблюдался из живого, обезболенного ChAT. Мышь eGFP.
При альтернативном методе экспрессия tdTomato в свежеиссеченном нерве из CHAT. tdTomato мыши был получен без дополнительной обработки тканей. Кроме того, аксоны были идентифицированы путем введения индикаторов или маркеров, таких как HcT или аденовирусы, кодирующие eGFP, в скелетные мышцы.
Репрезентативный анализ демонстрирует серию покадровых изображений, представляющую in vivo аксональный транспорт сигнальных эндосом в живых двигательных нейронах HB9. Мышь GFP. GFP имел более детальный рисунок в HB9.
Аксоны GFP. Разведение Мито. CFP мыши с ChAT.
Мыши tdTomato позволили визуализировать митохондрии в моторных аксонах. Кроме того, Узел Ранвье также может быть идентифицирован. Инъекция HcT в мышцы Мито.
Мыши CFP позволили одновременно визуализировать сигнальные эндосомы и митохондрии в пределах одних и тех же аксонов in vivo. Наблюдались антероградно и ретроградно движущиеся органеллы, а также застопорившиеся органеллы. Снижение анестезии во время процесса визуализации является преимуществом, поскольку оно может ограничить воздействие крупных дыхательных артефактов и, таким образом, упростить отслеживание и анализ аксонального транспорта.
Седалищные нервы могут быть поучительными для анализа РНК и белка, чтобы коррелировать динамику органелл с ключевыми компонентами аксонального транспортного механизма, такими как моторные белки и специфические для груза адаптеры.
