Questa ricerca fu sostenuta da sovvenzioni CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT NEL 202818 e NEL 203518; INPER 2018-1-163 e NIH P51OD11132. Ringraziamo Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro per l'eccellente assistenza tecnica.

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico della ricerca dell'Instituto de Neurobiología, universidad nacional autónoma de México, Messico e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La riproduzione, la cura e gli endpoint umani degli animali sono stati stabiliti seguendo lo standard ufficiale messicano (NOM-062-Z00-1999) basato sul "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Legge generale sulla salute per la ricerca sanitaria) della Secretaria della Salute messicana.
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	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno stadio per ottenere una coltura di cellule staminali neurali è il periodo di digestione con la soluzione enzimatica, che non dovrebbe superare i 30 minuti perché potrebbe diminuire la vitalità cellulare. Le neurosfere dovrebbero emergere a 8-10 giorni dopo la cultura iniziale; se non emergono entro il giorno 12, scartare la coltura e ripetere l'esperimento, riducendo il periodo di digestione. Un altro problema sono i vasi sanguigni che coprono il tessuto cerebrale. Dovrebbero essere completamente rimossi durante l...

La prateria(Microtus ochrogaster),un membro della famiglia Cricetidae, è un piccolo mammifero la cui strategia di vita si sviluppa come specie socialmente monogama e altamente socievole. Sia i maschi che le femmine stabiliscono un legame duraturo di coppia dopo l'accoppiamento o lunghi periodi di convivenza caratterizzati dalla condivisione del nido, dalla difesa del loro territorio e dall'esposizione di cure biparentali per la loro progenie1,2,3,4. Pertanto, l'arvicola della prateria è un modello prezioso per comprendere le basi neurobiologiche del comportamento socio-sessuale e delle menomazioni nella cognizione sociale5.
La neurogenesi adulta è uno dei processi più importanti della plasticità neurale che porta a cambiamenti comportamentali. Ad esempio, il nostro gruppo di ricerca ha riferito nelle arvicole maschili che la convivenza sociale con accoppiamento ha aumentato la proliferazione cellulare nella zona subventricolare (VZ) e nella zona subgranulare nel giro dentato (DG) dell'ippocampo, suggerendo che la neurogenesi adulta può svolgere un ruolo nella formazione del legame di coppia indotto dall'accoppiamento nelle arvicole della prateria (dati inediti). D'altra parte, sebbene le regioni cerebrali in cui vengono generati e integrati nuovi neuroni siano ben note, i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti in questi processi rimangono indeterminati a causa di inconvenienti tecnici nell'intero modellocerebrale 6. Ad esempio, le vie di segnalazione che controllano l'espressione genica e altre attività cellulari hanno un periodo di attivazione relativamente breve (rilevamento del fosfoproteoma)7. Un modello alternativo è le cellule staminali neurali adulte isolate e coltivate o le cellule progenitrici per chiarire i componenti molecolari coinvolti nella neurogenesi adulta.
Il primo approccio per mantenere i precursori neurali in vitro del cervello di mammiferi adulti (topo) è stato il test delle neurosfere, che sono aggregati cellulari che crescono in condizioni non aderenti che preservano il loro potenziale multipotente per generare neuroni, così come gli astrociti8,9,10. Durante il loro sviluppo, c'è un processo di selezione in cui solo i precursori risponderanno a mitogeni come il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) per proliferare e generare neurosfere8,9,10.
A nostra conoscenza, nessun protocollo è riportato in letteratura per ottenere progenitori neurali adulti dalle arvicole della prateria. Qui, abbiamo stabilito le condizioni di coltura per isolare i progenitori neuronali dalle nicchie neurogeniche e il loro mantenimento in vitro attraverso il test di formazione della neurosfera. Pertanto, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nella proliferazione, migrazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e dei progenitori, processi che sono ancora sconosciuti nell'arvicola della prateria. Inoltre, chiarire le differenze in vitro nelle proprietà delle cellule derivate dalla VZ e dalla DG potrebbe fornire informazioni sul ruolo delle nicchie neurogeniche nella plasticità neurale associate ai cambiamenti nel comportamento socio-sessuale e nei comportamenti cognitivi e ai deficit nelle interazioni sociali (disturbo dello spettro autistico e schizofrenia), che potrebbero anche dipendere dal sesso.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Le neurosfere sono aggregati cellulari primari che comprendono cellule staminali neurali e cellule progenitrici. Queste strutture 3D sono uno strumento eccellente per determinare il potenziale di differenziazione e proliferazione delle cellule staminali neurali, nonché per generare linee cellulari di quanto possa essere analizzato nel tempo. Inoltre, le neurosfere possono creare una nicchia (in vitro) che consente la modellazione dell'ambiente dinamico che cambia, come diversi fattori di crescita, ormoni, neurotrasmettitori, tra gli altri. Microtus ochrogaster (prateria arvicola) è un modello unico per comprendere le basi neurobiologiche dei comportamenti socio-sessuali e della cognizione sociale. Tuttavia, i meccanismi cellulari coinvolti in questi comportamenti non sono ben noti. Il protocollo mira ad ottenere cellule progenitrici neurali dalle nicchie neurogeniche della prateria adulta, che sono coltivate in condizioni non aderenti, per generare neurosfere. Le dimensioni e il numero di neurosfere dipendono dalla regione (zona subventricolare o giro dentato) e dal sesso dell'arvicola della prateria. Questo metodo è uno strumento notevole per studiare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche in vitro e i cambiamenti di neuroplasticità associati a comportamenti sociali come il legame tra coppie e la cura biparentale. Inoltre, potrebbero essere esaminate le condizioni cognitive che comportano deficit nelle interazioni sociali (disturbi dello spettro autistico e schizofrenia).

Le neurosfere erano formate da cellule staminali neurali isolate dalla VZ e dalla DG di arvicole di prateria adulta sia femminile che maschile. Circa 8-10 giorni dopo aver iniziato la coltura, le cellule avrebbero dovuto formare le neurosfere. Si noti che la piastra può contenere detriti nella coltura primaria (Figura 3A). Tuttavia, nel passaggio 1 la coltura dovrebbe consistere solo di neurosfere (Figura 3B).
Un numero maggiore di n...

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Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Abbiamo stabilito le condizioni per coltura delle cellule progenitrici neurali dalla zona subventricolare e dentare il giro del cervello adulto delle arvicole della prateria, come studio complementare in vitro, per analizzare le differenze dipendenti dal sesso tra nicchie neurogeniche che potrebbero far parte dei cambiamenti plastici funzionali associati ai comportamenti sociali.

Cultura delle Neurosfere Derivate dalle Nicchie Neurogeniche nelle Arvicole Della Prateria Adulta

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Questo metodo può aiutare a indagare le differenze dipendenti dal sesso nelle nicchie neurogeniche e a comprenderne la neuroplasticità, cambiamenti che sottolineano le interazioni sociali nell'arvicola della prateria. Il dosaggio delle neurosfere è uno strumento eccellente per determinare il potenziale di proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali e progenitrici. Per iniziare, posizionare una piastra di Petri su una superficie circondata da ghiaccio.Depositare il cervello sul piatto e aggiungere 20 millilitri di soluzione di lavaggio a freddo. Nel piano coronale, dividere il cervello in due blocchi di tessuto usando un bisturi, eseguendo il taglio a livello di bregma nell'asse anteriore-posteriore. Estrarre il tessuto della zona subventricolare, o VZ, dal blocco rostrale e il giro dentato, o DG, dal blocco caudale.Per sezionare la VZ, tenere uno degli emisferi con una forza di Dumont, e inserire le punte sottili di una seconda forza sotto il tessuto che linee il caudato-putamen. Aprire le forcep lungo l'asse dorsale-ventrale per separare il tessuto e raccogliere la VZ in un tubo di centrifuga con due millilitri di soluzione di lavaggio a freddo. Non mettere in comune il tessuto di più di due animali.Ripetere la microdisezione nell'altro emisfero e conservare il tubo con il tessuto sul ghiaccio. Per sezionare la DG, usa un bisturi per fare un taglio coronale nel blocco caudale, per ottenere due fette in cui si osserva la formazione ippocampale. Utilizzare le forcep Dumont per contenere una delle fette e fare un taglio orizzontale tra DG e CA1 con un'altra forza.Quindi, fare un'incisione verticale tra la DG e CA3, per separare la DG. Ripetere la dissezione nell'altro emisfero della prima fetta, quindi in entrambi gli emisferi nella seconda fetta. Raccogli i quattro pezzi DG di ogni arvicola in un tubo di centrifuga. Posizionare i tubi di centrifuga all'interno dell'armadio di biosicurezza e attendere circa 10 minuti che i frammenti di tessuto precipitino per gravità.Quindi, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere un millilitro di soluzione enzimatica calda a ciascun tubo. Incubare i tubi a 37 gradi per 10 minuti. Per disintegrare i frammenti di tessuto, pipettarli su e giù con una punta di millilitro, ma non pipettare più di 30 volte.Ripetere l'incubazione a 37 gradi Celsius, quindi pipettare di nuovo il tessuto. Aggiungere nove millilitri di mezzo N-2 a ciascun tubo per diluire il trattamento enzimatico e centrifugare i tubi a 200 volte g per quattro minuti. Scartare il supernatante, lavare le cellule con 10 millilitri di mezzo N-2 e ripetere la centrifugazione.Rimuovere il supernatante da ogni tubo e rimescolare i pellet cellulari del VZ e della DG rispettivamente in due millilitri e un millilitro del mezzo B-27. Filtrare ogni sospensione cellulare con un filtro cellulare da 40 micrometri per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Coltura delle celle filtrate in una piastra di fissaggio ultra-bassa da 24 pozzi, utilizzando due pozzi per il VZ e un pozzo per la DG. Aggiungere 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita dei fibroblasti 2 e 20 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico ad ogni pozzo, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e alta umidità per 48 ore.Dopo l'incubazione, rimuovere metà del mezzo di coltura e sostituirlo con un mezzo B-27 fresco, integrato con doppie concentrazioni dei fattori di crescita. Ripeti questo processo ogni tre giorni. Nei giorni in cui non è necessario cambiare il mezzo di coltura, aggiungere fattori di crescita a una concentrazione finale di 1X.Le neurosfere erano formate dalle cellule staminali neurali isolate dalla zona subventricolare e dentano il giro delle arvicole della prateria adulta sia femminile che maschile. Sebbene ci fossero detriti nella cultura primaria, solo le neurosfere erano presenti dopo il primo passaggio. Un numero maggiore di neurosfere sono state ottenute dalla zona subventricolare femminile che dalla zona subventricolare maschile, o dal giro dentato sia delle femmine che dei maschi, suggerendo che il numero di neurosfere ottenute dipende dalla zona proliferativa e dal sesso arvicolare.Il diametro delle neurosfere è stato misurato nei giorni 8, 11 e 14. È aumentato progressivamente per le arvicole maschili e femminili in entrambe le regioni neuronali, ma le neurosfere derivate dal cervello maschile erano più piccole rispetto a quelle derivate dal cervello femminile. Le neurosfere aderenti sono state caratterizzate il sesto giorno in presenza di fattori di crescita o il giorno 15 senza fattori di crescita.Al sesto giorno, in condizioni indifferenziate, le cellule derivate dalla neurosfera espressero Nestin, un marcatore per i progenitori neurali. È stato anche possibile identificare le cellule positive alla doppiacortina e il marcatore di proliferazione Ki-67, che indicano la presenza di precursori neuronali o neuroni immaturi. Tuttavia, la mancanza di colocalizzazione del Ki-67 con DCX suggerì la presenza di neuroblasti post-mitotici.Al giorno 15, in condizioni di differenziazione, sono stati trovati neuroni maturi e cellule con il fenotipo gliale, dimostrando il potenziale di differenziazione delle cellule isolate. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che essere in grado di riconoscere e avere una pratica precedente nella microdisezione è fondamentale per isolare solo le cellule dalle nicchie neurogeniche. Seguendo questo protocollo, gli esperimenti possono essere progettati per identificare i meccanismi coinvolti nella proliferazione, differenziazione e sopravvivenza delle cellule staminali neurali e progenitrici, processi che sono ancora sconosciuti nell'arvicola della prateria.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Views.  Universidad Nacional Autónoma de México. This method can help to investigate sex-dependent differences in the neurogenic niches, and to understand their neuroplasticity, changes that underline social interactions in the prairie vole. The assay of neurospheres is an excellent tool to determine the proliferation and differentiation potential of neural stem and progenitor cells. To begin, place a Petri dish on a surface surrounded by ice.Deposit the brain on the dish and add 20 milliliters of cold wash solution. In the coronal p...