Existen muchos protocolos para aislar miofibras individuales de los músculos esqueléticos de ratones adultos. Nuestro protocolo está diseñado para ratones muy jóvenes y para ratones pequeños con una miofibra muy frágil. Este procedimiento estandarizado se puede utilizar para estudiar las células madre musculares asistidas por miofibra durante el desarrollo postnatal o en modelos de ratón de enfermedades que hacen que las miofibras sean particularmente susceptibles al estrés mecánico.
El procedimiento será demostrado por Gloria Pegoli, estudiante de doctorado, y Federica Lucini, un post-doctorado, ambos de un laboratorio. Para la disección muscular y la cosecha, utilice un alfiler para fijar una extremidad posterior de un ratón eutanizado, muy joven o muy pequeño en una tabla de disección, y utilice pinzas afiladas para levantar el tendón inferior del tibialis anterior a la altura del tobillo. Corta el tendón y usa tijeras finas para cortar todo el músculo alrededor del músculo hasta el tendón a nivel de la rótula.
Coloque el músculo en un tubo de solución de digestión y levante el tendón inferior del extensor digitorum longus, tirando suavemente hacia arriba sobre el tendón para separar el digitorum longus extensor de otros músculos. Cortar y cosechar el músculo. Gire la pierna para ver los músculos de la espalda y levante el tendón de Aquiles.
Un músculo gastrocnemius se separará automáticamente de los otros músculos. Cortar el tendón superior en la parte posterior de la rótula y colocar el músculo en la solución de digestión. Levante el tendón externo de la pierna y enrolle las pinzas debajo del tendón para separar suavemente el tendón del músculo.
Luego, cortar para cosechar el músculo y recoger los mismos músculos de la otra pierna de la misma manera. Una vez recogidos todos los músculos, coloque el tubo de recogida en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 45 a 50 minutos e invierta vigorosamente el tubo 10 veces cada 10 minutos. Cuando los músculos comiencen a aflojarse y las miofiberas se vuelvan visibles, agitar las muestras una última vez antes de transferir cuidadosamente la suspensión de digestión en un plato de Petri precalentó o recubierto con suero de 100 milímetros que contenga 10 mililitros de solución de lavado.
Para aislar miofibers individuales, coloque el plato bajo un microscopio de disección y utilice una punta de pipeta de 200 microlitros recubierta de 200 microlitros para separar las fibras musculares individuales. Transfiera las miofiberas viables a un plato Petri recubierto de 35 milímetros que contenga cinco mililitros de solución de lavado precalentó. Cuando se hayan recogido todas las miofibras viables, equilibre las muestras de miofibra en la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos.
Si se necesitan más miofiberes, utilice una pipeta de vidrio de gran calibre para triturar la muestra de tejido muscular restante hasta que se liberen mecánicamente fibras adicionales. Cuando se hayan recogido suficientes miofibers, coloque el plato en la incubadora de cultivo celular durante una hora durante un período de equilibrio adicional. Al final de la incubación, transfiera las miofiberas individuales a un nuevo plato recubierto de suero de caballo precalentó que contenga el medio de cultivo adecuado y devuelva el plato a la incubadora de cultivo celular.
Para un análisis inmunofluorescente de las miofibras, después de la unión cruzada, eliminar todo pero suficiente sobrenadante, no eliminar las fibras y añadir al mismo tubo un mililitro de 0.5%Triton X-100 en PBS para una incubación de cinco minutos con agitación suave. Al final de la incubación, deje que las fibras se asienten durante cinco minutos antes de reemplazar el sobrenadante con 1,5 mililitros de PBS. Después de cinco minutos de agitación suave, deje que las fibras se asienten durante otros cinco minutos antes de reemplazar el sobrenadante con un mililitro de solución de bloqueo.
Después de una hora de agitación suave, reemplace la solución de bloqueo con una solución de bloqueo fresca que contenga anticuerpos primarios de interés para una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados con agitación suave. A la mañana siguiente, lave las fibras con tres lavados de cinco minutos en un mililitro de 0,25%Tween 20 en PBS con agitación suave y cinco minutos de sedimentación a temperatura ambiente para el lavado. Después del último lavado, etiquete las fibras con los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo adecuados diluidos en solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave, protegidos de la luz, seguidos de tres lavados en PBS más 0.1%Tween, protegidos de la luz, como se ha demostrado.
Después del último lavado, reemplace el sobrenadante con un mililitro de solución DAPI para una incubación de cinco minutos a temperatura ambiente con agitación suave, protegida de la luz. Al final de la incubación, lave las fibras y utilice una pipeta recubierta de solución de bloqueo con una punta cortada para recoger las fibras y esparcir cuidadosamente las fibras en un portaobjetos de vidrio. Coloque la corredera bajo un microscopio diseccionador, y usando sólo la luz natural reflejada por el espejo, utilice una nueva punta de pipeta de 200 microlitros para esparcir suavemente las fibras y eliminar el exceso de solución.
Después de eliminar el exceso de solución, deje que la diapositiva se seque en la oscuridad durante 10 a 15 minutos hasta que sólo quede un volumen muy pequeño de solución. A continuación, agregue un volumen adecuado de medio de montaje en las fibras antes de colocar cuidadosamente un resbalón de cubierta sobre los tejidos. Para recuperar un número suficiente de fibras largas y viables que pueden sobrevivir 96 horas en el medio rico en factor de crecimiento, cuatro músculos diferentes se cosechan y digieren típicamente.
Sólo las fibras más intactas deben transferirse al medio de cultivo. Las fibras rotas y otros desechos deben desecharse. Después de 72 horas de cultivo, las células satélite activadas generan agregados celulares enlazados al miofibra.
Observamos que el cultivo celular derivado del delta de Lamin ocho 11 ratones doble negativos están formados por un número menor de células. Después de 96 horas, las células satélite expresan MyoG, se hacen visibles dentro del grupo celular, iniciando la diferenciación hacia nuevos miofibers. En particular, se observa una dinámica retardada de la diferenciación de células de satélite en ratones noqueadores mutantes homocigotos Lamin en comparación con sus contrapartes de tipo salvaje.
Asegúrese de practicar los pasos de disección muscular como una cosecha muscular rápida y precisa es esencial para el éxito del experimento. Esta técnica permite el seguimiento de células satélite individuales durante la activación y diferenciación, facilitando el estudio de procesos clave subyacentes al crecimiento muscular y la regeneración bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.
