La investigación actual está financiada por la Fundación para la Investigación Solorz-Zak.

Todos los procedimientos quirúrgicos fueron sometidos a una evaluación ética y aprobados por el Gobierno de la Alta Baviera (número de referencia: 55.2-1-54-2532.3-13-13 y -2532-136-11). Los animales son macho C57BL / 6 ratones con un peso corporal de aproximadamente 25 g. 1. Preparación de los animales <ol><li> Inducir la anestesia al poner el ratón en una cámara. Limpie la cámara con el 5% de isoflurano hasta que el animal pierda el conocimiento. </li><li> Inyectar anestésicos premezclados por vía intraperitoneal: fentanilo (0,05 mg / kg), midazolam (5 mg / kg) y medetomidina (0,5 mg / kg). Compruebe los reflejos antes y periódicamente durante el procedimiento. Reinyectar un tercio de la cantidad inicial por hora para mantener la anestesia. </li><li> Intube orotracheally con un tubo hecho de un G catéter venoso 11 20. Para la intubación fijar el animal sobre una plataforma inclinada (30 °), retraer la lengua con unas pinzas dobladas, visualizar las cuerdas vocales con un microscopio de operación e insertar el tubo en la tráqueadurante la inspiración. </li><li> Coloque el ratón en una posición boca abajo y comprobar la correcta colocación del tubo con un trozo de algodón o una microcapnograph. </li><li> Conecte el tubo de intubación al respirador. Ventilar el ratón con aire ambiente, complementado con 25% de oxígeno con una frecuencia de 180-220 respiraciones / min y un volumen de carrera de 200-250 l. </li><li> Conecte el tubo de la intubación a la microcapnograph. Mantener el final de la espiración pCO 2 a 30 mm de Hg mediante el ajuste de la frecuencia de ventilación. </li><li> Inserte una sonda de temperatura rectal y colocar el animal en una almohadilla de calefacción con el fin de mantener 37 ° C de temperatura corporal central. </li><li> Aplique el sensor pulsoxímetro anular en la pata trasera derecha. </li><li> Abra la piel sobre el cráneo con un par de tijeras. La incisión debe ser de aproximadamente 0,5 cm de largo y entre el oído y el ojo. </li><li> Diseccionar el músculo temporal izquierdo con un bisturí desde el hueso temporal. </li><li> Pegue el medidor de flujo Doppler láser (LDF) de la sonda deel hueso temporal izquierdo. Mantenga la sonda en una posición fija hasta que el pegamento se endurece. </li><li> Perforar un agujero de aproximadamente 1,5 mm de diámetro con un taladro dental en el hueso temporal izquierdo. Enfriar la médula con solución salina para evitar el daño por calor. </li><li> Inserte la sonda de ICP en la cavidad craneal. Empuje hacia delante como dorsalmente como sea posible para evitar daños en el tejido cerebral y hemorragia. </li><li> Si la sonda está en la posición correcta, corregir y sellarlo con cemento. Deje secar el cemento durante 5 min. </li><li> Ponga el ratón con cuidado a una posición supina. </li><li> Para la monitorización continua de la presión arterial, la cateterización de la arteria femoral izquierda. </li><li> Conectar el catéter femoral para el dispositivo de control de presión de la sangre. </li></ol> 2. SAH Inducción <ol><li> Abra la piel con unas tijeras desde el esternón hasta la barbilla (2 cm). Diseccionar el tejido conectivo sin rodeos y empuje las glándulas salivales a un lado. </li><li> Exponer la arteria carótida común izquierda (CCA) y movilizarla. Preservar ladel nervio vago, que se ejecuta en la misma vaina de tejido conjuntivo como el CCA. Mueva craneal y exponer y movilizar a la ACI y la ECA con la misma técnica. </li><li> Ligar el ECA en la medida de lo posible craneal. </li><li> Prefijo dos ligaduras más para el filamento de la vuelta de la ECA. </li><li> Ocluir la CCA y el ICA temporalmente con microclips. Coloque los microclips con un aplicador microclip. Asegúrese de que los clips se aplican correctamente tirando suavemente hacia atrás. </li><li> Corte un agujero para la inserción de filamentos en el ECA con una tijera de los vasos. </li><li> Inserte un filamento Prolene 5-0 con 12 mm de longitud en la LCE. </li><li> Cierre el sitio de inserción con una ligadura preestablecido. </li><li> Retire los microclips con un aplicador microclip del CCA y el ICA. </li><li> Haga avanzar el filamento con una pinza en la ICA hasta que el ICP se eleva. Un aumento repentino de la ICP indica la inducción de sangrado. </li><li> Retirar el filamento de inmediato y ligar la ECA mediante el cierre de los dos prligaduras earranged consecutivamente. Esto evita el sangrado fuera del sitio de inserción. </li><li> La sutura de la piel herida. </li><li> Monitorear los parámetros fisiológicos de los animales durante otros 20 minutos. </li><li> Retire la PIC y sondas LDF y suturar la piel herida. </li></ol> 3. Fin del Experimento <ol><li> Perfundir el animal transcardialmente con 20 ml de solución salina (temperatura ambiente) seguido de 20 ml de PFA al 4% en PBS (4 ° C). </li><li> Diseccionar el cerebro fuera del cráneo. Cortar el cráneo en la línea media y entre las cavidades orbitales. A continuación, pelar el hueso desde el cerebro. </li><li> Evaluar la distribución de la sangre en el espacio subaracnoideo. </li></ol> 4. Consideraciones en el caso de la cirugía de la supervivencia (no se muestra en el video) <ol><li> Inyectar Carprofeno (4 mg / kg por vía subcutánea) para la analgesia postoperatoria directamente después de la inducción de la anestesia. Durante el periodo de observación post-operatorio carprofeno (4 mg / kg por vía subcutánea) se inyecta cada 24 horas. </li&gt; <li> En lugar de medir la presión arterial invasiva hacen uso de un sistema de monitoreo de la presión arterial no invasiva. </li><li> Para la terminación de la inyección de anestesia agentes antagonizar por vía subcutánea: naloxona (1,2 mg / kg), flumazenilo (0,5 mg / kg) y atipamezol (2,5 mg / kg). </li><li> Retirar la intubación del animal. </li><li> Después de recuperar de los reflejos poner al animal en una cámara de precalentado. Mantenga al animal en aproximadamente 32 ° C durante 24 horas. </li><li> Los animales son controlados regularmente por la respiración espontánea y su estado general durante las primeras horas después de la cirugía. Si el tronco cerebral se ve afectada animales presentan problemas de respiración y deben ser sacrificados. </li><li> Los animales se comprobaron diariamente para su estado general y el peso corporal, así como para los déficit neurológicos y sensoriales 15. </li></ol>

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	<li>Cahill, J., Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subarachnoid+hemorrhage:+is+it+time+for+a+new+direction.">Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction.</a> Stroke. 40, 86-87 (2009).</li><li>van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subarachnoid+haemorrhage.">Subarachnoid haemorrhage.</a> Lancet. 369, 306-318 (2007).</li><li>Lin, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage-induced+cerebral+vasospasm.">A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm.</a> J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).</li><li>Altay, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+subarachnoid+hemorrhage+to+induce+vasospasm+in+mice.">A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).</li><li>Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+induction+of+subarachnoid+hemorrhage+in+mice+by+intracranial+pressure+monitoring.">Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring.</a> J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).</li><li>Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+blood+flow+and+cerebral+perfusion+pressure+in+a+new+noncraniotomy+model+of+subarachnoid+hemorrhage+in+the+rat.">Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat.</a> Stroke. 26, 1086-1091 (1995).</li><li>Veelken, J. A., Laing, R. 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Res. 24, 510-516 (2002).</li><li>Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+and+recurrent+bleeding+are+the+major+causes+of+death+following+subarachnoid+hemorrhage.">Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage.</a> Stroke. 25, 1342-1347 (1994).</li><li>Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+intraoperative+monitoring+of+blood+pressure+and+arterial+pCO2+during+surgical+anesthesia+in+mice.">Non-invasive intraoperative monitoring of blood pressure and arterial pCO2 during surgical anesthesia in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 159, 261-267 (2007).</li><li>Hockel, K., Trabold, R., Scholler, K., Torok, E., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anesthesia+on+pathophysiology+and+mortality+following+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Impact of anesthesia on pathophysiology and mortality following subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 4, 5 (2012).</li><li>Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+optimal+anesthetic+protocol+for+measurements+of+cerebral+autoregulation+in+spontaneously+breathing+mice?.">What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice?.</a> Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).</li><li>Schwartz, A. Y., Masago, A., Sehba, F. A., Bederson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+subarachnoid+hemorrhage+in+the+rat:+a+refinement+of+the+endovascular+filament+model.">Experimental models of subarachnoid hemorrhage in the rat: a refinement of the endovascular filament model.</a> J. Neurosci. Methods. 96, 161-167 (2000).</li><li>Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+matrix+metalloproteinase-9+to+cerebral+edema+and+functional+outcome+following+experimental+subarachnoid+hemorrhage.">Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage.</a> Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Las opciones de tratamiento después de la HSA son escasos y en su mayoría ineficaces. Por lo tanto la fisiopatología del daño cerebral post-hemorrágica necesita ser entendido más con el fin de identificar nuevas dianas terapéuticas y desarrollar nuevos enfoques terapéuticos. Estandarizados y modelos animales bien reproducibles en animales modificados genéticamente, es decir, ratones, son cruciales para tales investigaciones. El modelo de CWP se ha convertido en un modelo ampliamente utilizado para HSA ...

SAH es el subtipo tiempos con el resultado menos beneficioso para los pacientes: el 40% de los pacientes mueren dentro de un mes después de que el sangrado 1 y sobrevivientes raramente tienen un desenlace clínico favorable. La gran mayoría del SAHS espontáneos (80%) son causados ​​por la ruptura de aneurismas intracraneales, que se encuentran principalmente a lo largo de la anterior y la arteria comunicante posterior, la arteria basilar, y la arteria cerebral media (ACM) 2. Tales aneurismas son difíciles de modelar en los animales y por lo tanto los modelos animales de la HSA se llevan a cabo ya sea por inyección de sangre en el espacio / ventrículos cerebrales subaracnoidea o por perforación endovascular de un recipiente subaracnoidea. Inyección de sangre autóloga en la cisterna magna es fácil de realizar y reproducible como el volumen de la sangre puede ser controlado directamente 3. Desgraciadamente, algunos aspectos de la fisiopatología HSA, por ejemplo, ellesión de los vasos, no puede ser modelado por este procedimiento. Otro enfoque técnico para la inducción de la HSA es la apertura de una vena intracisternal 4. Sin embargo, la CWP intraluminal en la sucursal de la CRM parece ser el procedimiento que los modelos de la fisiopatología de los seres humanos más estrechamente 5. El método fue desarrollado y descrito primero en ratas por Bederson y colegas y al mismo tiempo por Veelken y colegas 6,7. Más tarde, el modelo de perforación intraluminal se adaptó a ratones 8,9. Un filamento se inserta en la arteria carótida externa (ACE) y avanzó a la base del cráneo a través de la arteria carótida interna (ACI). En el punto de la MCA ramificación filamento perfora el recipiente e induce una hemorragia en el espacio subaracnoideo en la base del cráneo. Luego, la sangre se distribuye en el espacio subaracnoideo restante a lo largo de las fisuras y los vasos sanguíneos. El sangrado se detiene por la formación del coágulo en el sitio de la perforación, pero rebleedings, WHich suelen ser perjudiciales en pacientes 10, pueden ocurrir. Por consiguiente, el modelo de filamento endovascular se convirtió en un modelo de HSA ampliamente utilizado durante los últimos años. La desventaja del modelo de perforación filamento más frecuentemente mencionado es que el volumen de sangrado no se puede controlar directamente y por lo tanto puede ser variable. Esta variabilidad puede ser reducida significativamente por un control estricto de la fisiología animal y la PIC posthemorrágica. Los ratones tienen la gran ventaja de que un gran número de cepas modificadas genéticamente están disponibles. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño de los procedimientos quirúrgicos tienden a ser más complejo que en especies más grandes, por ejemplo, ratas o conejos. Por lo tanto la reducción de escala de las técnicas desarrolladas para las ratas a los ratones a menudo no da lugar a los resultados deseados, por ejemplo, como los ratones tienen un peso corporal y el volumen de sangre muy limitadas técnicas no invasivas para la presión arterial y análisis de gases en sangre, así como para la saturación de la hemoglobina y la monitorización de la frecuencia cardíacadeberá aplicarse siempre que sea posible. Por consiguiente, el objetivo de la publicación actual es para describir el modelo de perforación filamento para HSA en ratones y para demostrar cómo este modelo se puede realizar de una manera estandarizada y altamente reproducible.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>operation microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>KL2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Harvard Instruments</td>
			<td>Continuous Flow Vaporizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>respirator</td>
			<td>Hugo Sachs</td>
			<td>Minivent 845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcapnograph</td>
			<td>Hugo Sachs</td>
			<td>Type 340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>temperature controller</td>
			<td>FHC</td>
			<td>DC Temperature Controller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental drill</td>
			<td>Paggen</td>
			<td>Labset- N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICP monitor</td>
			<td>Codman</td>
			<td>ICP monitor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood pressure monitor</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Bridge Amp FE221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SP101IZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pulsoximeter</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>MouseSTAT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDF</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>Periflux 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>analog data monitor</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>Power Lab 16/35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cement for ICP probe fixation</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>Carboxylate cement</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue for LDF probe fixation</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td>Cyanoacrylate glue (Maxi Cure and Insta Set)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>venous catheter</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>Jelco winged i.v. catheter; REF 4076</td>
			<td>modified intubation tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing for femoral catheter</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>Fine Bore Polythene Tubing; ID 0.28 mm OD 0.61 mm; REF 800/100/100</td>
			<td>cut to 30 cm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filament for vessel perforation</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Prolene 5-0</td>
			<td>cut to 12 mm length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical equipment</td>
			<td>Fine Scientific Instruments</td>
			<td>forceps medical #5, vessel scissors 8 cm, microclip 4 mm jaw</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of subarachnoid hemorrhage

En esta publicación de vídeo se presenta un modelo estandarizado de ratón de la hemorragia subaracnoidea (HSA). El sangrado es inducida por el Círculo endovascular de perforación Willis (CWP) y probado por (ICP) de control de presión intracraneal. De este modo se consigue una distribución homogénea en la sangre espacios subaracnoideos que rodean la circulación arterial y fisuras del cerebelo. Fisiología animal es mantenido por la intubación, ventilación mecánica y monitorización continua en línea de diversos parámetros fisiológicos y cardiovasculares: la temperatura corporal, la presión arterial sistémica, la frecuencia cardíaca y saturación de la hemoglobina. De este modo la presión de perfusión cerebral se puede monitorizar bien que resulta en un volumen de menos variable de sangre extravasada. Esto permite una mejor estandarización de perforación filamento endovascular en ratones y hace que todo el modelo altamente reproducible. Por lo tanto, es fácilmente disponible para estudios farmacológicos y fisiopatológicos en tipo salvaje y genéticaLY alterado ratones.

Mortalidad Una vez que la técnica de cirugía que se domina el procedimiento no provoca ninguna mortalidad intraoperatoria. También sangrado se puede lograr en casi todos los animales. La mortalidad postoperatoria es del 30-40%, con la mayoría de los animales mueren en el día 1 después de la cirugía (Figura 5). ICP valora después de la HSA El ICP antes del sangrado es de alrededor de 4 mmHg. Sangrado resultado en un ...

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A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Un modelo de ratón estándar de la hemorragia subaracnoidea por el Círculo de Willis intraluminal perforación se describe. Perforación de vasos y hemorragia subaracnoidea son monitoreados por el monitoreo de la presión intracraneal. Además diversos parámetros vitales se registran y se controlan para mantener las condiciones fisiológicas.

Un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

a-murine-model-of-subarachnoid-hemorrhage

Research

JoVE Journal

Medicine

19.4K vistas.  University of Munich Medical Center.  Un modelo de ratón estándar de la hemorragia subaracnoidea por el Círculo de Willis intraluminal perforación se describe. Perforación de vasos y hemorragia subaracnoidea son monitoreados por el monitoreo de la presión intracraneal. Además diversos parámetros vitales se registran y se controlan para mantener las condiciones fisiológicas. 