Denne nye effektive metoden for å isolere underpopulasjoner av spermatocytter og spermatider fra voksne mus kan brukes til å undersøke molekylære mekanismer underliggende meiose og spermatogenese. Denne metoden bruker en lav cytotoksisitet DNA bindende fargestoff med et bredt eksitasjonsspektrum som kan brukes på de fleste brukte FACS-ordrer. Denne metoden er veldig grei.
Det mest utfordrende aspektet er flyten cytometri gating men den detaljerte gating strategi bør hjelpe med å tilpasse protokollen til andre celler sorters. Å demonstrere prosedyren vil være Yu-Han Yeh, en forskningsassistent fra Satoshi Namekawa's Laboratory. Etter høsting av begge testiklene fra en åtte uker gammel mannlig mus, legg vevet i en 60 millimeter petriskål som inneholder to milliliter iskald PBS og fjern tunikaalbuginea.
Forsiktig skille testiklene med tang for å litt spre seminiferøse tubuli. Og overfør tubuliene til en dråpe frisk iskald PBS i en 100 millimeter petriskål. Bruk tangen til å forsiktig løsne tubuli og vaske tubuli i tre ekstra dråper PBS som nettopp demonstrert.
Etter den siste vasken, legg de untangled seminiferøse tubuli i et 15 milliliter rør, som inneholder to milliliter dissosiasjonsbuffer for en 20-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, bruk en 1000 mikroliter pipette til å forsiktig pipette tubuli 20 ganger, før du returnerer røret til inkubatoren i ytterligere seks minutter. På slutten av inkubasjonen pipette vevet ytterligere 20 ganger, før du returnerer røret til inkubatoren.
Etter tre minutter, pipette forsiktig tubuli 10 ganger eller til ingen synlige vev stykker gjenstår, før du stopper dissosiasjonen med 10 milliliter FACS buffer. Deretter sentrifuge til vev suspensjon to ganger ved hjelp av ytterligere 10 milliliter for frisk FACS buffer for andre vask for å fjerne spermatozoa og så mye rusk som mulig. For å flekke cellene for strømningscytokometrisk analyse, re-suspendere pellet i tre milliliter FACS buffer.
Og filtrer cellesuspensjonen gjennom en 70 mikron nyloncellesil, inn i et 50 milliliter rør. Etter telling, overføre 10% av cellene til et nytt rør på is som den uopphetede negative kontrollen. Og bland seks mikroliter dcv-flekk grundig inn i den gjenværende cellefjæringen.
Etter en 30-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius i mørket med mild risting hvert 10. Og filtrer cellene gjennom en 35 mikron nylon mesh sil i en fem milliliter FACS rør på is. For flow cytometrisk analyse av cellene, opprett et nytt eksperiment i flytanalyseprogramvaren, og under regnearkverktøymenyen klikker du ny tetthet for å opprette et fremoversp scatter-område kontra backscatter områdetetthetsplott på en lineær skala.
Klikk nytt histogrammet for å opprette en DCV blå histogram plott på en logaritmisk skala. Og klikk start og registrer for å begynne å behandle det uopphetede utvalget. Mens prøven er i gang, klikker du på detektor- og terskelinnstillinger for å justere både forover- og sidespavsedede PMT-spenninger for å plassere de uopphetede cellene på skalaen av strø- og bakspartikkelplottet.
Juster PMT-spenningen for jappykanalen for å finne posisjonen til DCV negativ befolkning i det første tiåret av DCV blå histogrammet logaritmisk plott. Klikk deretter stopp for å fjerne det uopphetede utvalget. Etter kort innvirring og lasting av den beisede prøven, klikker du neste rør for å opprette et nytt regneark for prøven.
Angi cytometeret til å skaffe minst en ganger 10 til de seks hendelsene, og klikk start og ta opp. Deretter klikker du ny tetthet for å opprette punkthøyde fremover kontra punktbredde fremover. Og DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala.
På fremover scatter området versus backscatter området tetthet tomten, bruk polygon verktøyet til å tegne en port kalt celler for å inkludere de fleste av cellene og for å utelukke små rusk. Bruk denne porten på den fremre punkthøyden versus fremover punktbredde plott og bruke rektangelverktøyet til å tegne en enkelt celle port for å utelukke ikke-enkeltceller. Påfør enkeltcellens port på DCV blå versus DCV rød tetthet plot og justere skalaen for å fange en utvidet profil.
Bruk polygonverktøyet til å tegne en DCV-port for å utelate de uopphetede cellene og sidepopulasjonen, og bruk porten på et DCV blått histogrammet plott på en lineær skala. De tre store toppene refererer til det forskjellige 1C-, 2C- og 4C DNA-innholdet. Opprett en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala.
Og tilbake gate DCV gate på tomten for å finne 1C og 4C populasjoner. Opprett en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala. Og bruk ellipseverktøyet til å tegne en port på 1C-befolkningen.
Bruk polygonverktøyet til å gate 4C-populasjonen med en kontinuerlig kurve. Og lag en annen DCV blå versus DCV rød tetthet plott på en lineær skala. Bruk polygonverktøyet til å lage en 4C en port.
I en ny fremover ved side scatter plot, bruk ellipse verktøyet for å lage pachytene, diplotene og leptotene, zygotene spermatocyte porter. Når alle portene er trukket, opprette en ny DCV blå versus DCV rød farge dot plot på en lineær skala for å søke om 4C gate for å sikre at de tre populasjonene er i en kontinuerlig rekkefølge innenfor porten. Deretter oppretter du et nytt fremoversp scatter-område versus backscatter area tetthet tomt på en lineær skala, og velg den enhetlige størrelsen på celler som en ren rund spermatid befolkning.
Etter sortering er de representative renhetene til de separerte leptotene, zygotene, pachytene og diplotene spermatocyttfraksjonene vanligvis mellom 80% til 90%som bekreftet av SYCP3 og Gamma H2AX immunostaining. Renheten av den runde spermatidfraksjonen kan bekreftes av kjernefarging med DCV i kombinasjon med Sp56 og H1t farging, og er også typisk rundt 90%Levedyktigheten til de isolerte cellepopulasjonene er vanligvis over 95%Og gjennomsnittlig total avkastning på hver brøkdel fra en enkelt voksen mus er vanligvis tilstrekkelig for ulike nedstrøms analyse. De sorterte cellene kan brukes til ulike neste generasjons sekvenseringsanalyse for bedre å utforske genuttrykk og regulering under spermatogenese.
