השבתה במחזור התא היא תכונה מרכזית של תאי גזע hematopoietic. פרוטוקול זה מסייע להבין את ההתנהגות של HSCs אנושיים רגיעה במבחנה בתנאים פיזיולוגיים קרובים. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים יכולים לבדוק את ההשפעה של תרכובות שונות, חומרים מזינים, או חלבונים המסדירים את מצב מחזור התא, כמו גם בידול של HSCs באופן מדרגי ללא שימוש במודלים של בעלי חיים.
תרופות נגד סרטן יש השפעות משתנות על ההישרדות של HSCs השבתה ורוכבי אופניים אבות. פרוטוקול זה מאפשר למצוא סוכנים שחוסכים HSCs רגיעה או סוכנים שפוגעים באופן סלקטיבי בתאי גזע לויקמיים רגיעה. מי שידגים את ההליך יהיה הירושי קוביאשי, עמית מחקר בכיר ממעבדת טאקובו.
כדי להתחיל, להמיס 16 מיליגרם לכל מיליליטר נתרן פלמיטט, 30 מיליגרם למיליליטר נתרן oleate, וארבעה מיליגרם לכולסטרול מיליליטר במתנול בצינורות זכוכית. אחסן את פתרונות השומנים ב 30 מעלות צלזיוס שלילי להפשיר אותם לפני השימוש. בצינור זכוכית טרי, מערבבים את פתרונות השומנים כדי להשיג את הריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר פלמיאט, 100 מיקרוגרם למיליליטר אולאט, ו -20 מיקרוגרם לכולסטרול מיליליטר.
לאדות את מתנול על ידי העברת גז חנקן דרך תמיסת השומנים. לחלוטין לאדות את המתנול הנותר על ידי חימום צינור הזכוכית באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. הכינו את מדיום DMEM/F-12 עם HEPES וגלוטמין.
מוסיפים פניצילין וסטרפטומיצין גופרתי לריכוז סופי של 50 יחידות ו-50 מיקרוגרם למיליליטר בהתאמה. ניתן לאחסן את המדיום בארבע מעלות צלזיוס למשך חודשיים לפחות. הוסיפו 4% מ-BSA למדיום DMEM/F-12 עם HEPES וגלוטמין, ולאחר מכן התאימו את רמת ה-pH של המדיום ל-7.6 באמצעות פתרון נתרן הידרוקסידי.
מוסיפים את המדיום לצינור הזכוכית עם השומנים. ממיסים לחלוטין את השומנים על ידי sonication. אם המדיום אטום לאחר sonication, להאריך את זמן sonication.
כאשר BSA ושומנים מומסים, הדגימות צריך להיות מאוחסן שלילי 80 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך חודשיים. הוסף 0.001X של אינסולין, transferin, נתרן סלניט, ואתנולאמין תערובת DMEM / F-12 ולאחר מכן לסנן את המדיום המעורב באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף גורם תא גזע אנושי או SCF וטרומבופויאטין אנושי או TPO למדיה התרבות בריכוז הסופי של שלושה ננוגרם למיליליטר כל אחד.
העבר 200 מיקרוליטרים של מדיית התרבות שהוכנה בעבר עם ציטוקינים לצלחות שטוחות תחתונות של 96 באר. כדי למנוע אידוי של המדיום, למלא את כל בארות שאינם בשימוש עם 100 כדי 200 microliters של PBS. התחדשו בתאי הגזע ההמטוטופיאטיים הממוינים או ב-HSCs במדיית תרבות ללא ציטוקינים ב-60 תאים למיקרוליטר.
Aliquot 600 תאים לתוך כל באר. פחות מ 300 תאים יוביל וריאציה טכנית גדולה יותר culturing יותר מ 1, 000 תאים בבאר אחת יש להימנע בגלל מחסור בחומרים מזינים או הצטברות של ציטוקינים שליליים או כימוקינים. תרבית את התאים באינקובטור מרובה גזים לח ב-37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני ו-1% חמצן.
לאחר שבעה ימים של culturing HSCs מטוהרים, עד 80% מהתאים הציגו סמן CD34 חיובי CD38 פנוטיפים שליליים. מספר התא הכולל היה תלוי בריכוז הציטוקינים. ריכוזים גבוהים יותר של SCF ו- TPO המושרה כניסה לתוך מחזור התא, התפשטות ובידול.
מספר HSCs פנוטיפיים המאופיינים על ידי הסמן CD34 חיובי, CD38 שלילי, CD90 חיובי CD45 RA פנוטיפים שליליים גדל ביחס ריכוזי SCF או TPO ואילו התדירות בין התאים הכולל ירד. לאחר שלושה חודשים של השתלה של HSCs מח עצם למבוגרים מתורבתים, שחזור ניתן להעריך כפונקציה של התדירות שלהם בדם ההיקפי של אדם CD45 חיובי מורין, CD45 שלילי Ter119 תאים שליליים. שלושה שושלת כולל CD19 חיובי B תאים, CD13 שלילי, CD33 תאים מיאלואידים חיוביים, ו CD3 חיובי T תאים היו מחדש בעכברים NOG מושתל עם או מופשר טרי או מתורבת HSCs.
בעקבות התרבות, HSCs יכול להיות נתון פרופיל ביטוי גנים כגון PCR בזמן אמת רצף RNA. אימות תפקודי באמצעות השתלה לעכברים לקויי חיסון יכול להתבצע גם. חוקרים יכולים להשוות ישירות רכיבה על אופניים HSCs רגיעה בתנאים מוגדרים על ידי התאמת ריכוזי ציטוקינים.
זה יעזור להבין את תוכניות ההתחדשות העצמית הספציפיות ל- HSC, מנגנוני התנגדות ללחץ ותכונות מטבוליות, שקשה לבדוק בהגדרות vivo.
