細胞周期静止は造血幹細胞の重要な特徴である。このプロトコルは、近い生理学的条件下でのヒトHSCの静止の挙動を理解するのに役立つ。このプロトコルを使用すると、研究者は、動物モデルを使用せずに、細胞周期の状態を調節する様々な化合物、栄養素、またはタンパク質の効果をスケーラブルな方法でスケーラブルにテストすることができます。
抗癌薬は、静止HSCとサイクリング前駆物質の生存に様々な影響を及ぼす。このプロトコルは、静止したHSCまたは静止した白血病幹細胞を選択的に損傷する薬剤を予備にする薬剤を見つけることを可能にする。この手順のデモンストレーションは、タクボ研究所の小林浩史上級研究員です。
まず、パルミチン酸ナトリウム1ミリリットル当たり16ミリグラム、オレイン酸ナトリウム1ミリリットル当たり30ミリグラム、ガラス管中のメタノール中のミリリットルコレステロールあたり4ミリグラムを溶解する。脂質溶液をマイナス30°Cで保存し、使用前に解凍してください。新鮮なガラス管に、脂質溶液を混合して、パルミチン酸1ミリリットル当たり100マイクログラム、オレイン酸1ミリリットル当たり100マイクログラム、および1ミリリットルコレステロール当たり20マイクログラムの最終濃度を得る。
脂質溶液を通して窒素ガスを通してメタノールを蒸発させます。37°Cの水浴でガラス管を加熱することにより、残りのメタノールを完全に蒸発させます。ヘペスおよびグルタミンとDMEM/F-12培地を準備します。
ペニシリンとストレプトマイシン硫酸塩を加えて、最終的な濃度が50単位、1ミリリットル当たり50マイクログラムです。培地は、少なくとも2ヶ月間摂氏4度で保存することができます。DMEM/F-12培地に4%のBSAを添加し、その後、水酸化ナトリウム溶液を使用して培地のpHを7.6に調整します。
脂質を入ったガラス管に培地を加えます。完全に超音波処理によって脂質を溶解します。媒体が超音波処理後に不透明である場合は、超音波処理時間を延長します。
BSAと脂質が溶解したら、サンプルは80°Cの負の80度で保存し、2ヶ月以内に使用する必要があります。0.001Xインスリン、トランスフェリン、セレニットナトリウム、エタノールアミン混合物をDMEM/F-12に加え、0.22マイクロメートルフィルターを使用して混合培地を濾過します。使用前に、ヒト幹細胞因子またはSCFおよびヒトトロンボポエチンまたはTPOを、それぞれ1ミリリットル当たり3ナノグラムの最終濃度で培養培地に添加する。
前に調製した培養培地の200マイクロリットルをサイトカインで平底96ウェルプレートに移す。培地の蒸発を避けるために、使用されていない井戸をすべて100~200マイクロリットルのPBSで満たします。培養培地で並べ替えられた造血幹細胞またはHSCを、1マイクロリットル当たり60細胞でサイトカインなしで再懸濁する。
アリコート600細胞を各ウェルに入す。300未満の細胞は、より大きな技術的変動をもたらし、1つの井戸で1,000以上の細胞を培養することは、栄養不足または不利なサイトカインまたはケモカインの蓄積のために避けるべきである。5%の二酸化炭素と1%の酸素雰囲気で37°Cで加湿した多気インキュベーターで細胞を培養します。
精製されたHSCを培養した7日後、細胞の最大80%がマーカーCD34陽性およびCD38陰性の型を示した。総細胞数はサイトカイン濃度に依存した。SCFおよびTPOのより高い濃度は、細胞周期への侵入を誘導し、増殖および分化する。
マーカーCD34陽性、CD38陰性、CD90陽性およびCD45 RA陰性の特徴を有する表向きHSCの数は、SCFまたはTPO濃度に比例して増加した一方、全細胞間の頻度は減少した。培養成体骨髄HSCの移植の3ヶ月後、再構成は、ヒトCD45陽性マウス、CD45陰性Ter119陰性細胞の末梢血におけるそれらの頻度の関数として評価することができる。CD19陽性B細胞、CD13陰性、CD33陽性骨髄細胞、およびCD3陽性T細胞を含む3系統を、解凍したばかりのか培養したHSCのいずれかで移植したNOGマウスで再構成した。
培養後、HSCはリアルタイムPCRおよびRNAシーケンシングなどの遺伝子発現プロファイリングを行うことができる。免疫欠損マウスへの移植を用いた機能検証も行うことができる。研究者は、サイトカイン濃度を調整することによって、定義された条件下でのサイクリングと静止HSCを直接比較することができます。
これは、静止HSC固有の自己再生プログラム、ストレス耐性メカニズム、および生体内での設定でテストするのが難しい代謝特性を理解するのに役立ちます。
