Этот протокол может быть использован для характеристики динамики немуклинового миозина на уровне белка, который может информировать о подвижных свойствах, которые способствуют их роли в клетках. Это быстрый, воспроизводимый и строго контролируемый метод, который можно использовать для изучения влияния различных регуляторных условий на подвижность миозина, информируя об их клеточном поведении. Эти методы могут быть использованы для исследования того, как болезнетворные мутации в немышечные миозинах влияют на их поведение на уровне одной молекулы и ансамбля.
Общий подход его методологии может быть применен к различным другим цитоскелетным системам, таким как характеристика очищенных кинезинов и динеинов микротрубочами. Универсальность этого протокола может вызвать вопросы о том, какие флуорофоры и химические условия наиболее подходят, но метод может быть оптимизирован относительно быстро. Понимание того, как настроить и покрыть прототочные камеры, создает прочную основу, на которой можно адаптироваться к различным условиям для этих экспериментов.
Для начала приготовьте однопроцентный раствор нитроцеллюлозы в амилацетате и поместите круглую фильтровальную бумагу диаметром 125 миллиметров на дно пластины для культивирование ткани. Загрузите восемь квадратных крышек на стойку и тщательно вымойте их примерно двумя-пятью миллилитрами 200-стойкого этанола, а затем двумя-пятью миллилитрами дистиллированной воды. Затем привод крышки полностью скользит с помощью фильтро-воздушной линии или азотной линии.
Медленно пипетку 10 микролитров однопроцентного раствора нитроцеллюлозы вдоль одного края одного скольжения крышки. Размажьте его по остальной части крышки, используя сторону 200-микролитрового наконечника пипетки одним плавным движением. Затем поместите этот покровный слип на чашку для культивирование тканей нитроцеллюлозной стороной вверх.
Повторите это для оставшихся листов крышки и дайте им высохнуть. Протрите слайд микроскопа бумагой для оптической линзы, чтобы очистить от крупного мусора. Вырежьте два куска двусторонней ленты, длиной примерно два сантиметра, и поместите один кусок вдоль середины длинного края предметной области микроскопа.
Поместите второй кусок ленты примерно на два миллиметра ниже первого куска ленты так, чтобы они были параллельными, создавая проточную камеру, которая может вместить примерно 10 микролитров раствора. Осторожно приклейте одну из нитроцеллюлозных чехлов на ленту так, чтобы сторона, покрытая нитроцеллюлозой, непосредственно контактировала с лентой. Используя наконечник пипетки, осторожно нажмите на интерфейс слайд-ленты, чтобы убедиться, что крышка правильно приклеивается к слайду.
Затем отрежьте лишнюю ленту, свисающую над краем горки лезвием бритвы. Подготовьте растворы для Миозина 5а и держите их на льду. Продуть в 10 микролитрах Миозина 5а через скользящую протоковую камеру и подождать одну минуту.
Затем протоите в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT. Повторите это дважды и подождите минуту после третьей стирки. Используйте угол папиросной бумаги или фильтровальной бумаги, чтобы провести раствор через канал, аккуратно поместив угол бумаги на выход из блок-камеры.
Затем промыть 10 микролитрами мотористого буфера с помощью DTT. Пипетка черного актинового раствора с помощью одного миллилитра шприца и иглы 27-го калибра для сдвига актиновых нитей перед введением этого раствора в камеру. Добавьте черный актин в камеру в присутствии одного миллимоляра АТФ в 50 миллимолярных МБ с одним миллимолярным DTT.
Далее текут в 50 микролитрах буфера подвижности с DTT и одним миллимоляром АТФ для истощения камеры свободных актиновых нитей. Промывайте 10 микролитрами буфера подвижности с DTT три раза, чтобы истощить камеру любого АТФ. Продуть в 10 микролитрах 20 наномолярного раствора резус-актина, содержащего буфер подвижности с DTT, и подождать одну минуту, чтобы обеспечить строгое связывание актиновых нитей с миозином 5а, прикрепленным к поверхности крышки.
Промывайте 10 микролитрами 50-миллимолярного буфера подвижности с DTT дважды, чтобы удалить несвязанный RH актиновых нитей. Расход в 30 микролитрах конечного буфера. Записывайте изображения на флуоресцентный микроскоп, используя длину волны возбуждения 561 нанометр для визуализации резус-актина.
Подготовьте растворы для анализа моторики Myosin 5a и держите их на льду. Промывайте их камерой с 10 микролитрами мотористого буфера с DTT. Расход в 10 микролитрах по одному миллиграмму на миллилитр BSA в буфере подвижности с DTT.
Повторите это дважды, подождав через минуту после третьей стирки. Используйте салфетку или фильтровальную бумагу, чтобы провести раствор через канал, осторожно поместив угол бумаги на выходе из проточной камеры. Затем трижды промыть камеру 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT.
Протойте в 10 микролитрах раствора NeutrAvidin в буфер подвижности с DTT и подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами этого раствора. Протекать в 10 микролитрах brh актина, содержащего буфер подвижности с DTT, используя большой наконечник пипетки.
И подождите одну минуту. Затем трижды промыть 10 микролитрами буфера подвижности с помощью DTT. Поток в 30 микролитрах конечного буфера с 10 наномолярами миозина 5а.
И сразу же загрузить на полное внутреннее отражение флуоресцентного микроскопа. Начните запись, как только будет найден оптимальный фокус для визуализации TIRF. Очистка немуклинального миозина 2b, эссенциалных легких цепей и регуляторных легких цепей, а также миозина 5а и кальмодулина оценивалась путем выполнения SDS-PAGE.
Анализ скользящей актиновой нити показывает характеристики идеального и отслеживаемого фильма с плавными движениями меченых актиновых нитей. Черная актиновая промывка гарантировала, что мертвые головки миозина были удалены из поля измерения, что еще больше способствовало общему плавному движению актиновых нитей. Выходные изображения отслеживания нити из программы fast track были получены для немуклиновых Myosin 2b и Myosin 5a.
Репрезентативная гистограмма показывает, что скорость скольжения Actomyosin 2b составляет 77 нанометров в секунду. А у Actomyosin 5a — 515 нанометров в секунду. В отсутствие метилцеллюлозы актиновые нити не остаются так тесно связанными поверхностью, покрытой миозином, в результате чего она плюхает близко к поверхности немышельных покрытий, покрытых миосином 2b.
Движение миозина наблюдалось на поверхностно-привязанных флуоресцентных актиновых нитях с использованием перевернутого анализа подвижности. Важно срежевать немаркированный актин перед введением его в проточную ячейку для промывки черного актина, что позволит плавно транслокировать актин. Дополнительные эксперименты могут исследовать, как на подвижность миозина влияют мутации миозина, вызывающие нагрузку белки, ионная сила и регуляторные белки.
Различные клеточные состояния могут быть восстановлены для будущих исследований. Эти методы позволяют проводить биохимические и биофизические исследования того, как различные изоформы миозина различаются по своим подвижным и механическим свойствам на уровне одной молекулы и ансамбля.
