Denne video vil fokusere på forberedelse af gær salmonella til kryo-elektron tomografi Vi vil gå gennem arbejdsgang fra celle dyrkning til kryo-elektron tomografi Saccharomyces cerevisiae dyrkes til ion prøve forberedelse i suspension Det anbefales at arbejde i sterile forhold inde i laminar flow box ti milliliter steril gær udvundet til medium til celle dyrkning tilsættes til sterilisering kolbe en milliliter sterile tyve procent glukose tilsættes til kolben med dyrkning medium en gær koloni er omhyggeligt plukket fra vores dyrkning plade og overføres til den forberedte vækst medium i dyrkning kolbe dyrkning kolbe er derefter dækket med folie og blandet godt til at sprede celler cellekultur er placeret i inkubatoren og dyrkes ved tredive grader med konstant agitation, indtil den eksponentielle fase er nået gær celle kultur er vokset op til eksponentiel fase og celle fysisk tæthed måles ved holdemåler mod et rent medium som en reference prøve celle kultur er koncentreret til OD1 eller OD30 ud over fem procent af glycerol før blanche frysning Elektro-mikroskopiske gitre overflade rengøres og aktiveres til påføring af celle suspension af plasma gitre er placeret i glød udledning kammer mod kulstof side op og proceduren for plasma rengøring er indstillet til tredive til femogfyrre sekunder EM net har nu, og de er klar til celle prøvepåføring Vitrifikation af gærcelleaffjedring på EM-gitre sker ved blanchefrysning i den flydende ethan ved hjælp af Vitrobot-maskine Forberedelsen af flydende ethan sker ved at flydende ethangas i en metalkop afkølet med flydende nitrogen EM-gitter med celleophæng er blottet af filterpapir fra bagsiden og af ikke-klæbende plast bøjet fra forsiden af kulstofsiden Temperaturen inde i Vitrobot-kammeret er indstillet til atten grader og fugtighed til hundrede procent ventetid, blot tid og blot kraft er indstillet på Vitrobot skærm samt glød udledning nettet er plukket af Vitrobot pincet og monteret på instrumentet tre punkt fem mikroliter af Saccharomyces cerevisiae suspension anvendes til kulstof side af nettet inde i Vitrobot klimakammer Suspension skal blandes korrekt, før hver anvendelse af nettet nettet er blanche frosset ind i de flydende ethanelektronemikroskopgier med vitrified celler opbevares under flydende nitrogenforhold eller monteres i gitterpatronen til belastning i kryo SEM-mikroskop Gitteret med vitrified celler fastgøres derefter i gitterpatronen, der er egnet til indlæsning til både SEM- og TEM-mikroskoper C-klipring monteres på klippeværktøjet og afkøles i flydende nitrogengitter placeres på gitterpatronens kul, der vender nedad og klippes med C-klip ring prøve placeres derefter i den særlige gitter boks Prøven til lamila forberedelse er indlæst til dual beam FIB / SEM mikroskop og passer med kryo-fase forberedelse kammer lastning pot er korrekt afkølet og fyldt med flydende nitrogen prøve indehaveren kaldet shuttle er placeret i og afkølet samt gitter boks med prøve overføres fra opbevaring dewar til gryden og gitre er placeret i to slots i shuttle carbon side med celler vender op i tilfælde af brug af FIB gitter patroner udskæringen af gitterpatronen skal være omhyggeligt justeret til tolv i rumfærgen gitre er strammet af skruen og rumfærgen er vendt ned til lastning position lastning pot er placeret i overførsel station og dækket med låg Overførsel kammer med lastning pot er placeret på toppen af låget og pumpes gennem lav vakuum shuttle med gitre er fastgjort på stangen og lukket inde i de små overførsel kammerkamre indsamlet til forberedelse kammer pumpes og shuttle er indsat på kryo-fase i høj vakuum SEM kammer fase vippes til femogfyrre grader og flyttet fire millimeter på centrum position af nettet indsætte nålen af gasindsprøjtning system skaber beskyttende lag af organisk på biologisk prøve mod stråling skader under fokuseret ion stråle fræsegitre er derefter sputter belagt med tyndt slør af uorganisk metal til at skabe ledende lag på biologisk materiale fokuseret ion stråle fræsning af lameller i celle klynge eller monolayer er gjort i få trin fase flyttes til fræsning vinkel region af interesse er fundet og top og bund fræsning mønstre er skabt ru lameller er fræset med gradvis fald i FIB strøm og lamella tykkelse den endelige polering af lameller er udføres kun med øvre mønster og lav FIB strøm for at undgå frontend skader og curtaining effekt på lameller overflade elektron stråle viser fremskridt under fræsningsprocessen her kan vi se den endelige polerede lameller Den endelige tykkelse af lameller skal være mindre end to hundrede og halvtreds nanometer for at være gennemsigtig for transmission af elektron stråle illustrationen af lamella fræset i celleklynge og monolayer med fordele og ulemper ved begge prøvetyper gitre med lamali er meget forsigtigt overført gennem forberedelse kammer tilbage til lastning pot pot er afkølet ned og fyldt med frisk og ren flydende nitrogen for at undgå is forurening af fræset lamali gitre fjernes fra rumfærgen og returneres tilbage til gitter boks prøve med fræset lamali er endelig overført til transmission elektron cryo mikroskop gitter skal være halvfems grader roteret før indsættelse til TEM autoloader kassette for at sikre korrekt orientering af lameller med hensyn til TEM tilt adgang Lamili er screenet og region af interesse for erhvervelse af kryo-elektron tomografiske data er lokaliseret Lamella hovedaksen er vinkelret på tilt akse af mikroskopet for at se det rigtige synsfelt i høje hældning vinkler dosimetric metode bruges til at indsamle cryo elektron tomografi data indsamlet tomogram behandles derefter i Etomo software og monolayer segmenteret i Amira software I denne protokol viste vi dig, hvordan du effektivt forbereder en gærcelleprøve til en lamella mikromaskine ved hjælp af kryofokuseret ionstrålefræsning, og hvordan du forbereder og behandler elektrontomografidata og cellelamali