Meiose er en evolusjonær konservert hendelse i eukaryoter, noe som er avgjørende for gametogenese og seksuell reproduksjon. Vår protokoll gir en effektiv metode for studier av meiotisk deling og spermatogenese. Vi har beskrevet en rekke protokoller for analyse av spermatocytter.
Denne teknikken kan brukes til observasjon av meiotisk spindel, homologe kromosomer og de subcellulære organeller i spermatocytter. Denne metoden kan brukes til analyse av meiotisk deling, generering av genredigering dyremodeller og gentransfeksjon i vev eller organer. Eksperimenter bør opprettholde et sterilt miljø under abdominal kirurgi, og ta hensyn til temperatur, tid og viktige eksperimentelle forhold i denne protokollen.
Demonstrere prosedyren vil være Miss Meng-Fei Xu, en post-graduate fra laboratoriet mitt. Begynn konstruksjonen av den GSK923295 medierte sentromerproteinet E eller CENP-E hemming musemodellen ved å binde opp de bedøvede muselemmene og feste dem på voksbrettet. Etter desinfisering av operasjonsområdet, bruk en steril skalpell for å lage en åpning på fem millimeter i bukhulen til musen etterfulgt av å plassere sterile kirurgiske klemmer på huden.
Trekk deretter den epididymale fettputen med steril dissekerende tang for å finne testiklene ved hjelp av steril pinsett. Etter å ha festet testiklene med steril tang under et stereoskop, injiser sakte 10 mikroliter GSK923295 i seminiferøse tubuli ved en endelig konsentrasjon på 10 mikromolar ved bruk av 10 mikroliter riodin. Når du er ferdig, skyv testiklene tilbake i bukhulen og sutur operasjonsstedet som beskrevet i tekstmanuskriptet.
For gradient dehydrering av de innsamlede mus testikler, inkubere prøven sekvensielt i ulike medier som beskrevet i manuskriptet. Etter seriell inkubasjon, plasser vevet i bunnen av innebyggingsboksen og tilsett smeltet paraffin i esken. For fullstendig størkning av parafinen, avkjøl prøvene ved fire grader Celsius i seks timer.
Senere fester du prøven på holderen av ultramikrotomen mens du holder vinkelen mellom prøven og knivoverflaten ved 5 til 10 grader. Juster stykketykkelsen til fem mikrometer for å forberede de fem mikrometer tykke seksjonene ved hjelp av en ultra mikrotom. Etter klargjøring, spred prøvesliden i et vannbad ved 40 grader Celsius før du tørker seksjonene i lysbildetørkeren i 12 timer ved 37 grader Celsius.
Etter 12 timer, utfør sekvensiell inkubasjon av lysbildene som forklart tidligere. Skyll deretter lysbildene i destillert vann i fem minutter etterfulgt av farging med Mayers hematoksylinløsning i seks minutter ved romtemperatur. Skyll deretter de fargede lysbildene i rennende vann i fem minutter og inkuber med destillert vann i to minutter.
Inkuber lysbildene i 1% etanolhydroklorid i tre sekunder og skyll deretter og rennende vann i to minutter. Flekk prøven med 1% eosin i 15 sekunder, etterfulgt av seriell inkubasjon. Når du er ferdig, forsegle lysbildene med 15 mikroliter nøytral tyggegummi og en 24 x 50 millimeter deksel.
For immunfluorescens, plasser lysbildet i antigeninnhentingsløsningen for å koke under høyt trykk i en trykkoker i fire minutter for antigenhenting. Avkjøl deretter lysbildet naturlig til romtemperatur før du skyller to ganger med destillert vann i fem minutter og med PBS i fem minutter. For å permeabilisere cellene, inkuber lysbildet i 500 mikroliter 0,25% Triton X-100 i PBS i 10 minutter og skyll deretter lysbildene med PBS i fem minutter tre ganger.
For antigenblokkering, inkuber prøven med 300 mikroliter 3% bovint serumalbumin eller BSA i en time og med de primære antistoffene i 3% BSA i PBST i 16 timer ved fire grader Celsius. Etter inkubering, legg lysbildet i en fuktet boks for å forhindre at vevet tørker ut. Varm opp lysbildene naturlig til romtemperatur i 30 minutter.
Kast det primære antistoffet, etterfulgt av å skylle lysbildet i PBST i fem minutter tre ganger. Fortynn sekundære antistoffer med 3% BSA og PBST. Inkuber deretter prøven med fortynnede sekundære antistoffer i en til to timer ved 37 grader Celsius.
Etter å ha skyllet prøven i PBST i fem minutter fem ganger, flekker kjernene med 50 mikroliter DAPI i fem minutter ved romtemperatur. Monter dekselet med anti-fade-monteringsmediet og forsegl dekselet med neglelakk. For flowcytometri, samle musetestikler i seks centimeter petriskåler og kutt testiklene i en kubikkmillimeter stykker ved hjelp av kirurgisk saks.
Fordøy deretter testiklene i en milliliter 1% kollagenase i et 1,5 milliliter sentrifugerør i 10 minutter ved 37 grader Celsius. For å utfelle spermatogene celler, sentrifuger prøven ved 1.000 G i fem minutter og kast supernatanten før du tilsetter en milliliter 0.25% trypsin EDTA-løsning i prøven i 20 minutter ved 37 grader Celsius. Senere sentrifugerer prøven ved 1.000 g i fem minutter.
Kast supernatanten for å inkubere de utfelte cellene med en milliliter 70% kald etanol i mer enn åtte timer ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering ved 1.000 G i fem minutter, samle cellesedimenter og flekker spermatogene celler med 500 mikroliter propidiumjodid eller PI-fargeløsning ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Etter inkubasjon, filtrer prøven ved hjelp av en 300 mesh-skjerm for å eliminere celleavfall og samle cellene i et strømningsrør for å lagre cellene ved fire grader Celsius.
Oppdag fluorescenssignaler og lysspredning ved eksitasjonsbølgelengden ved 488 nanometer ved hjelp av et strømningscytometer. Analyser DNA-innholdet i prøven og lysspredning ved hjelp av ModFit MF LT 32-programvaren. Etter testikkelinjeksjon av GSK923295 ble spermatogen bølge endret i sædrørene på grunn av CENP-E-hemming.
Den spermatogene bølgen i sædtubuli var imidlertid regelmessig og organisert i kontrollgruppen. Det ble observert at de mange homologe kromosomene ikke var justert ved ekvatorialplaten etter CENP-E-hemming. Videre førte CENP-E-hemming til økning av metafase I-spermatocytter i sædkanaler.
Immunfluorescensanalysen viste redusert antall antisynaptonemal kompleksprotein tre eller SYCP3 positive celler per seminiferøs tubuli etter CENP-E-hemming. På den annen side ble SYP3-punktene per metafasecelle og SYP3-strekkene per celle ikke påvirket i de GSK92395 gruppene. Avstandene til spindelpolene i metafase I spermatocytter ble økt på grunn av CENP-E-hemming.
Den representative analysen viser at CENP-E-hemming resulterte i reduksjon av de haploide cellene i GSK 923295 gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Forholdet mellom de diploide cellene og aneuploidicellene ble ikke signifikant påvirket etter CENP-E-hemming. Omvendt økte forholdet mellom tetraploidcellene i GSK923295 gruppen enn kontrollgruppen.
Transmisjonselektronmikroskopianalysen av de spermatogene cellene viste den forstyrrede organisasjonen av spermatogene celler i GSK923295-gruppen. Eksperimentøren bør være oppmerksom på injeksjonsposisjonen, legemiddeldosen, injeksjonsmetoden og suturmetoden under abdominal kirurgi og testikkelinjeksjon. Denne teknikken sammen med in vivo elektroporering fokusert på målrettede proteiner og genredigeringsverktøy kan brukes innen miotisk deling og spermatogenese.
