Agradecemos calorosamente a todos os pacientes e suas famílias pela participação no estudo. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Associação Francesa Vaincre la Mucoviscidose; Associação Francesa ABCF 2 e Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos descritos pela Declaração de Helsinque e pela lei Huriet-Serusclat sobre ética em pesquisa humana.
1. Preparação de frascos e diferentes mídias
<ol><li>Prepare amplificação, líquido-ar e meio de congelamento conforme descrito na Tabela 1.</li>
	<li>Prepare uma solução de estoque de colágeno humano IV dissolvendo 50 mg de colágeno em 100 mL de ácido acético glacial de ...

<ol>
	<li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum.">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).</li><li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR:+folding,+misfolding+and+correcting+the+&#916;F508+conformational+defect.">CFTR: folding, misfolding and correcting the &#916;F508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li><li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR.">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li><li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles:+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial.">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li><li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction.">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens.">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li><li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells.">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137 (2020).</li><li>Bukowy-Biery&#322;&#322;o, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures:+how+far+are+we.">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li><li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators.">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).</li><li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl&#8722;+currents+in+human+nasal+epithelial+cells.">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl&#8722; currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies.">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).</li><li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response.">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li><li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology.">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li><li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro.">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li><li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies.">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li><li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants.">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li><li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance.">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).</li><li>Sch&#246;gler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling.">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).</li><li>M&#252;ller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface.">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis.">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li><li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study.">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).</li><li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis.">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li><li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome.">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li><li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells.">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li><li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+(CRC)-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells.">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li><li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+(Trikafta)+combination.">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).</li><li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free,+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research.">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator.">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).</li><li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum/feeder-free+single+human+embryonic+stem+cells.">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li><li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators.">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).</li><li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants.">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li></ol>

Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes relacionados a esta publicação ou produção de vídeo científico.

O uso de células epiteliais nasais derivadas do paciente como substitutos para células epiteliais brônquicas humanas (HBE) para medir a atividade de CFTR no contexto da medicina personalizada tem sido proposto como propriedades de células de reprodução de HNE na cultura 9,11. A forte vantagem do HNE sobre as culturas celulares HBE é que elas são facilmente e não invasivamente amostradas. As medições de corrente de curto-circuito nas culturas celulares ...

A Fibrose Cística (CF) é uma doença recessiva autossômica resultante de mutações no gene cftr (Cistic Fibrostic Fibrosis Conductance Regulator, regulador de condução da fibrose transmembrana) que leva à ausência ou disfunção da proteína CFTR, um canal de ânion localizado na superfície apical da epitélio 1,2. Os recentes avanços na terapia cftr melhoraram o prognóstico da doença, e os últimos medicamentos aprovados que combinam corretivos cftr e potencializadores de CFTR levaram a grandes melhorias na função pulmonar e qualidade de vida para pacientes cf portadores da mutação mais frequente p.Phe508del mutação (F508del)3,4. Apesar desse progresso terapêutico promissor, cerca de 10% dos pacientes com CF são inelegíveis, pois carregam mutações que são inscuáveis por esses moduladores de CFTR. Para esses pacientes, é necessário testar outras drogas ou combinações de medicamentos para encontrar a combinação mais eficiente para mutações específicas, destacando a importância de terapias personalizadas.
As células epiteliais nasais humanas (HNE) são fáceis de coletar por escovação nasal simples e não invasiva e permitem quantificação do transporte cíclico de Cloreto mediado por AMP (Cl−) como um índice de função CFTR. As células HNE produzem um modelo preciso das vias aéreas humanas, mas sua vida útil é limitada na cultura. Graças à otimização das técnicas de cultura, as células HNE primárias derivadas do paciente podem ser reprogramadas condicionalmente com o inibidor de quinase (ROCKi), amplificado e diferenciado em um epitélio pseudo-estratificado em condições de interface ar-líquido (ALI) em filtrosmicroporosos 5,6. Existem inúmeros protocolos culturais para a cultura HNE (comercialmente disponíveis, sem soro, "caseiro", co-cultura com células alimentador, etc.), e a escolha das condições de mídia e cultura foram descritas para impactar o crescimento, a diferenciação populacional celular e a função epitelial 7,8. O protocolo aqui apresenta um método simplificado, sem alimentação, de amplificação ROCKi que permite obter com sucesso um grande número de células HNE que são então diferenciadas em ensaios de função CFTR para CFTR.
Demonstramos que, em células HNE diferenciadas, um tratamento de 48 horas com moduladores cftr é suficiente para induzir a correção eletrofisiológica da corrente cl dependente de CFTR e que a correção observada in vitro pode estar correlacionada com a melhora clínica do paciente9. As células HNE, portanto, representam um modelo apropriado não apenas para pesquisas fundamentais de CF, mas para estudos pré-clínicos com testes moduladores CFTR específicos do paciente. Nesse contexto de terapia personalizada, o objetivo do protocolo foi validar que as células HNE criopreservadas de pacientes cf, cultivadas em nossas condições, eram um modelo apropriado para estudos de correção de CFTR, e resultados semelhantes poderiam ser esperados ao comparar o transporte cl dependente de CFTR de células frescas e descongeladas. O estudo também avaliou a eficácia de diferentes moduladores de CFTR ao utilizar terapias duplas e triplas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABBV-2222</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABBV-974</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 594 goat secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha-tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB25031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 8 antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>61038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Muc5AC antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-20118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotech</td>
			<td>sc-10804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td></td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colimycin</td>
			<td>Sanofi</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>C-7521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cytology brush</td>
			<td>Laboratory GYNEAS</td>
			<td>02.104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epinephrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>E4375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-Nutrient Mixture</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferticult</td>
			<td>Fertipro NV</td>
			<td>FLUSH020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 25</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flasks 75</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156.499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20104.298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>SLCJ0893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>I0516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2+ and Ca2+-free DPBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tazocillin</td>
			<td>Mylan</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>CLS3470-48EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Sigma-Aldrich Merck</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0,25%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-445</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S8851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-661</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S7059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-770</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VX-809</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine naphazoline 5%</td>
			<td>Aspen France</td>
			<td>provided by Necker Hospital Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary human nasal epithelial cells: biobanking in the context of precision medicine

As células epiteliais nasais humanas (HNE) são fáceis de coletar por escovação nasal simples e não invasiva. As células HNE primárias derivadas do paciente podem ser amplificadas e diferenciadas em um epitélio pseudo-estratificado em condições de interface ar-líquido para quantificar o transporte de Cloreto mediado por AMP cíclico (Cl-) como um índice da função CFTR (Cystic Fibrosis Conductance Regulator, regulador de condução transmembrana). Se etapas críticas como qualidade da escovação nasal e densidade celular após a criopreservação forem executadas de forma eficiente, as células HNE podem ser biobancaradas com sucesso. Além disso, estudos atuais de curto-circuito demonstram que o congelamento não modifica significativamente as propriedades eletrofisiológicas das células HNE e a resposta aos moduladores CFTR. Nas condições de cultura utilizadas neste estudo, quando menos de 2 x 106 células são congeladas por criovial, a taxa de falha é muito alta. Recomendamos congelar pelo menos 3 x 106 células por criovial. Mostramos que as terapias duplas que combinam um corretivo cftr com um potencializador CFTR têm uma eficácia de correção comparável para a atividade de CFTR em células HNE F508del-homozygous. Terapia tripla VX-445 + VX-661 + VX-770 aumentou significativamente a correção da atividade cftr em comparação com a dupla terapia VX-809 + VX-770. A medida da atividade de CFTR em células HNE é um promissor biomarcador pré-clínico útil para orientar a terapia moduladora CFTR.

Células HNE frescas cultivadas na interface ar-líquido exibem características típicas do epitélio respiratório polarizado e diferenciado, conforme avaliado pela imunostaining (Figura 1). As células HNE se refaziem em uma camada heterogênea de células epiteliais (queratina positiva 8 imunostaining) que imitam a situação in vivo de um epitélio respiratório pseudo-estratificado composto de ciliado (coloração positiva alfa-tubulina) e células de cálco não ciliadas prod...

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Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

Células Epiteliais Nasais Humanas Primárias: Biobanco no Contexto da Medicina de Precisão

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Este protocolo destaca os principais passos para amplificar, diferenciar e criopreservar células epiteliais primárias. Em nossas condições culturais, as células epiteliais nasais primárias imitam o epitélio pulmonar. Isso permite culturas derivadas do paciente e estudos de medicina personalizados de células frescas ou biobancaradas.As culturas epiteliais nasais derivadas do paciente podem ser usadas para avaliar a atividade do CFTR e ajudar na terapia de fibrose cística, avaliando a resposta individual do paciente a novas terapias. Demonstrando o procedimento estará Aurelie Hatton, uma engenheira do meu laboratório. Para começar, cresça células epiteliais nasais ou HNE, em 10 mililitros de meio de amplificação.Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em um frasco revestido de colágeno de 75 centímetros quadrados até atingir 80 a 90% de confluência. Mude o meio a cada 48 a 72 horas. Mais tarde, lave as células com 10 mililitros de magnésio e DPBS livres de cálcio.Aspire e descarte o soro fisiológico. Antes de adicionar dois mililitros de 0,25% trypsin e devolver o frasco à incubadora por oito a 12 minutos. Mais tarde, toque o frasco firmemente com uma palma para ajudar o desprendimento celular.Adicione 10 mililitros do meio de amplificação para parar a reação enzimática. Enxágue vigorosamente o frasco usando uma pipeta de 10 mililitros para elaborar e expulsar o meio de amplificação sobre a superfície do frasco para enxaguar e desprender as células e coletar as células em um tubo de 15 mililitros. Centrifugar a suspensão celular a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernatante.Suspenda a pelota em cinco a dez mililitros de meio de amplificação. Então conte as células em um hemótmetro. Após a contagem celular, centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernasce.Em seguida, suspenda novamente a pelota no meio de congelamento enriquecido para obter três a cinco vezes 10 às seis células por mililitro e coloque em um frasco de crio. Congele lentamente as células reduzindo a temperatura em aproximadamente um grau Celsius por minuto em um recipiente apropriado de criofreezing a menos 80 graus Celsius. No dia seguinte, mova a amostra preservada para um recipiente de armazenamento de nitrogênio para armazenamento a longo prazo.Aqueça o meio de amplificação recém-preparado em um banho de água definido para 37 graus Celsius. Remova os frascos criográficos do tanque de armazenamento de nitrogênio e coloque-os rapidamente no banho de água, tomando cuidado para não submergir todo o frasco em água. Remova os frascos crioculos do banho de água quando permanecer apenas uma pequena gota congelada.Limpe os frascos com 70% de álcool e coloque-os sob o capô. Usando uma pipeta de um mililitro, transfira as células descongeladas para um tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione um mililitro de meio de amplificação quente de uma maneira em gota.Após um minuto, adicione mais um mililitro de meio de amplificação e espere por um minuto. Adicione 10 mililitros de meio de amplificação e centrífuga a 500 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o supernaspe.Suspenda a pelota em um volume de meio de amplificação necessário para alcançar uma densidade celular de uma vez 10 a seis células por mililitro. Depois de semear as células em um frasco revestido de colágeno de 25 centímetros quadrados, contendo meio de amplificação, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Observe visualmente a expansão celular ao longo de dois a três dias antes de realizar a amplificação celular como demonstrado anteriormente.Semente as células a uma densidade de 3,3 vezes 10 a quinta células por filtro em filtros porosos revestidos de colágeno de 0,33 centímetros quadrados, complementados com 300 microliters de meio de amplificação no lado apical e 900 microliters de meio líquido de ar no lado basolateral. Após três dias, aspire o meio apical e a cultura das células na interface ar-líquido por três a quatro semanas no meio ar-líquido para estabelecer um epitélio diferenciado. Troque o meio basal a cada 48 a 72 horas.Células HNE frescas cultivadas na interface ar-líquido exibiam características típicas do epitélio respiratório polarizado e diferenciado. Nas 78 amostras de células HNE, as taxas de sucesso foram comparadas na escovação nasal semeada imediatamente e após um a sete dias de transporte em um meio de descarga. O percentual médio inicial de culturas bem sucedidas foi de 82% e atingiu 87% em amostras semeadas entre zero a cinco dias.83% das amostras que se diferenciaram com sucesso em novas condições também foram bem sucedidas em amostras criopreservadas. Da mesma forma, em amostras que não se diferenciaram em condições frescas, 71% também não tiveram sucesso em condições de congelamento. Além disso, 50% das amostras congeladas entre duas a três vezes 10 a seis células por frasco criogeno não conseguiram crescer quando descongeladas, atingindo 80% por menos de duas vezes 10 às seis células.Para a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à mudança de corrente de forskolina e curto-circuito em resposta ao inibidor cftr 172 em células HNE tratadas por DMSO, não foi observada diferença significativa entre HNE descongelado fresco ou congelado. Após o tratamento, ambos os tipos de células apresentaram correção significativa com um aumento na mudança de corrente de curto-circuito em resposta à forskolina e uma diminuição na mudança de corrente de curto-circuito em resposta ao inibidor de CFTR 172. a resposta corretiva das terapias duplas da função CFTR foram avaliadas em comparação com as células HNE tratadas por DMSO, a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à forskolina e em resposta ao inibidor CFTR 172 foram significativamente melhoradas tanto pelo VX-809 quanto pelo VX-770, quanto pelo VX-661 mais o VX-770.Foram comparadas três terapias moduladoras de CFTR diferentes em HNE de seis pacientes homozigos F508del. Quando usado em combinação com um corretivo e potencializador CFTR, tanto o vértice quanto um modulador CFTR, corrigiu a mudança de corrente de curto-circuito em resposta à mudança de corrente de forskolina e curto-circuito em resposta ao inibidor CFTR 172 em uma medida semelhante. Ao congelar células HNE, é importante ter pelo menos 3 milhões de células por frasco criogeno para aumentar as chances de um bom resultado após o descongelamento.A atividade de CFTR em células de HNE tem se mostrado um bom modelo preditivo para avaliar e ajustar terapias personalizadas na fibrose cística.

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Research

JoVE Journal

Biology

2.6K Views.  Institut Necker Enfants Malades. This protocol highlights the key steps for amplifying, differentiating, and cryopreserving primary nasal epithelial cells. In our culture conditions, primary nasal epithelial cells mimic the lung epithelium. This allows patient derived cultures and personalized medicine studies from fresh or biobanked cells.The patient-derived nasal epithelial cultures can be used to evaluate CFTR activity and help with cystic fibrosis therapy by evaluating the patient's individual response to new ther...