Este método pode ser utilizado para avaliar in vitro a toxicidade de novas formulações de produtos oftálmicos. Ao refinar as concentrações de produtos químicos e formulações de produtos usando células oculares in vitro, o uso de animais para avaliar a segurança de novos produtos pode ser minimizado. Os ensaios in vitro avaliam desfechos de toxicidade que não podem ser avaliados in vivo, como determinar o efeito de uma substância química na função mitocondrial, integridade da membrana celular e atividade enzimática.
Avaliar a toxicidade celular in vitro é fundamental para a compreensão dos potenciais mecanismos de toxicidade. Isto é essencial para estabelecer uma dose máxima tolerável de produtos químicos terapêuticos no olho. Quem demonstrará o procedimento será Nijani Nagaarudkumaran, pesquisadora do Laboratório Jones.
Comece assentando ambos os pHCECs e iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com tampa inferior de vidro deslizando em uma concentração de 1 x 10 até o 5º com 1 mililitro de meio de epitélio ocular humano, ou HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs 1 conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto por 48 horas em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo 4 calceína micromolar, 8 homodímero de etídio micromolar 1 e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.
Após a coloração das células, ajustar o microscópio confocal de varredura a laser para capturar os comprimentos de onda de excitação e emissão, conforme descrito no manuscrito do texto. Obter as imagens bidimensionais e tridimensionais seguindo as instruções do manuscrito. Semeando as células a 5 x 10 a 4 por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 3 horas.
Após a incubação, reduza o volume do meio nos poços para 300 microlitros. Em seguida, exponha as células à radiação UVA a 6,48 watts por metro quadrado e à radiação UVB a 1,82 watts por metro quadrado a 37 graus Celsius por 5 e 20 minutos em experimentos separados. Após a radiação UV, adicione 200 microlitros de HOEM fresco a cada poço e incube por 20 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, colete o sobrenadante celular em cada poço e transfira-o para tubos estéreis de polipropileno de 2 mililitros. Congele o sobrenadante a menos 80 graus Celsius. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa.
Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM e F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mililitro da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.
Células de sementes a 5 x 10 ao quarto por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços. Incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 3 horas. Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, que incluem cloreto de benzalcônio a 0,001%, ou BAK, peróxido de hidrogênio a 0,01% e dodecil sulfato de sódio a 0,0025% em PBS por 5 e 15 minutos.
Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio por 1 mililitro de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% por 4 horas. Meça a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes a 530 nanômetros de excitação e 590 nanômetros de comprimento de onda de emissão.
Transfira os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 horas em tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mililitros e congele-os a 80 graus Celsius negativos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV seguindo as instruções do kit para quantificar interleucina 6, interleucina 8, interleucina-1 beta e TNF-alfa. Células de sementes a 1 x 10 a 5ª por mililitro de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno 1 de 24 poços e incubam a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
Após a incubação, remova o meio e exponha as células a 1 mililitro de toxinas químicas, incluindo 0,001%BAK, 0,005%BAK e 0,01%BAK em PBS por 5 minutos. Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mililitro de PBS e adicione 1 mililitro de HOEM a cada poço. Após 20 horas de incubação, corar as células com 500 microlitros de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína, homodímero de etídio e anexina 5 por 20 minutos a 37 graus Celsius.
Ajustar o microscópio para medir intensidades nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 630 e 675 nanômetros para anexina 5, 495 e 515 nanômetros para calceína AM e 528 e 617 nanômetros para coloração de etídio 1. Em seguida, adquirir imagens das células usando o microscópio de fluorescência. Os iHCECs foram encontrados para ser pequenas células que variam de 10 a 20 micrômetros e os pHCECs estavam na faixa de 20 a 50 micrômetros após 24 horas de crescimento.
Diferenças semelhantes na faixa de tamanho foram observadas para iHCECs e pHCECs após 48 horas de crescimento. Em comparação com as células não expostas aos raios UV, a atividade metabólica dos pHCECs irradiados foi significativamente reduzida aos 20 minutos de exposição. Para iHCECs, a atividade metabólica diminuiu para as células irradiadas em 5 e 20 minutos.
Portanto, levou um tempo de exposição maior para reduzir a atividade metabólica dos pHCECs do que os iHCECs. A liberação máxima de citocinas pelos iHCECs foi aos 5 minutos de exposição aos raios UV. A liberação máxima de citocinas para pHCECs ocorreu aos 20 minutos de exposição aos raios UV.
Em termos de quantidades totais de citocinas inflamatórias liberadas, os pHCECs liberaram substancialmente mais interleucina-1 beta, interleucina 8 e TNF-alfa do que os iHCECs, enquanto os iHCECs liberaram mais interleucina 6. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs mostraram uma mudança na liberação de interleucina 6 após a exposição aos três produtos químicos. A BAK causou uma diminuição na liberação de interleucina 6 em comparação com o controle para HCECs primários e imortalizados.
O peróxido de hidrogênio causou um aumento na liberação de interleucina 6 de iHCECs, e uma diminuição na liberação de pHCECs. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs foram significativamente danificados em 0,005% e 0,1% de BAK. Após a realização de avaliações in vitro da toxicidade das células oculares, outros modelos animais de toxicidade ocular poderiam ser realizados para determinar o efeito de um produto ocular nos nervos da córnea ou no sistema imunológico ocular.
Essas técnicas são essenciais para determinar os mecanismos de toxicidade da formulação de produtos químicos e de produtos no olho e ajudarão a minimizar o uso de animais para testes de desenvolvimento de produtos.
