Este trabalho foi financiado pelo NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) e concede NIH AR052785 e AR046786 (AEO e W. MW).

1. Prepare 0-2 dias de idade ratos recém-nascidos para a dissecção da pele <ol><li> Euthanize filhotes de rato, utilizando uma câmara de CO 2 durante pelo menos 20 min. Deixar filhotes em gelo até uma hora, até que a dissecção. P0-P2 ratos são altamente recomendados como células preparadas a partir de ratos mais velhos têm capacidade reduzida progenitor que resulta em menores rendimentos de enxerto. Preparar um prato de etanol a 70% (para o passo 1.3), e três pratos de solução de lavagem (para o passo 3) quando estiver pronto para executar a dissecção da pele. Descongele Solução Dispase e deixe-a 4 ° C. Cervical deslocar filhotes após superexposição CO 2 para garantir a eutanásia. </li><li> Coloque filhotes sacrificados em uma placa de cultura sobre gelo e transferência para uma câmara de fluxo estéril. </li><li> Lave filhotes por breves instantes, a imersão em etanol 70% e coloque sobre prato de cultura estéril. </li></ol> 2. Dissecar pele do rato <ol><li> Cortar cada um dos membros e na base da cauda do torso com tesoura estéril. </li><li> Segure firmemente o corpo entre um par de cufórceps rved e fazer uma incisão na pele do dorso da cabeça à cauda, ​​usando um bisturi sem penetrar na fáscia. </li><li> Retire cuidadosamente a pele longe da linha média do mouse. </li><li> Segure o mouse exposto firmemente com o lado longo do fórceps curvos e inserir um outro par de pinças curvas debaixo da pele na extremidade posterior do mouse e puxe a pele sobre os quadris em direção ao meia ventral do mouse. </li><li> Retire cuidadosamente a pele completamente fora do mouse em um movimento suave e descarte da carcaça. </li></ol> 3. Lavar a pele e incubar com Solução Dispase <ol><li> Coloque a pele no primeiro prato de solução de lavagem com o lado da derme para baixo. Espalhe pele para fora e agitar com uma pinça. Deixar a pele no primeiro prato da solução de lavagem, enquanto dissecar a pele em seguida. </li><li> Depois de colocar a pele próximo dissecados no primeiro prato de solução de lavagem, transferir a pele antes de o segundo prato de solução de lavagem. Mantenha peles em poe solução de lavagem segundo até que todas as peles são coletados. Transfira a totalidade das peles para a lavagem final, agitar brevemente. </li><li> Adicionar 10 ml de gelo Dispase frio para um estéril prato de cultura de 10 cm. Transfira pele para a solução Dispase e achatar pele derme voltada para baixo. </li><li> Flutuador da pele para 8-16 horas a 4 ° C (solução alternativa: 1 hora a 37 ° C). </li></ol> 4. Derme separado e Epiderme <ol><li> Transfira para um prato pele nova cultura estéril e achatar pele derme voltada para baixo. Cuidadosamente pressione a derme de um canto com um bisturi. </li><li> Segure a epiderme com uma pinça e lentamente casca de distância da derme. Epiderme deve descascar como uma peça. A epiderme será branca e fina ea derme deve ser marrom, mais grosso e gelatinoso. </li><li> Separa-se os dois tecidos separados em placas de cultura estéreis. <ol class="lalpha"><li> Para fazer um enxerto dérmico gene específico knockdown / superexpressão, tomar derme e pique em pedaços muito pequenos, com tbisturis WO. Descarte epiderme. No dia da infecção (passo 7), dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados, as células epidérmicas se combinar com lentiviral infectadas células dérmicas. </li><li> Para fazer um enxerto epidérmico gene específico knockdown / superexpressão, corte cada epiderme em 6-8 pedaços menores. Descarte derme. No dia da infecção (passo 7), dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados, as células dérmicas de combinar com lentiviral infectadas células epidérmicas. </li></ol></li></ol> 5. Dissociar células primário do mouse dérmicas (mDCs) de tecido picada <ol><li> Dissociar mDCs incubando partes dérmicos com solução de colagenase feita de fresco a 37 ° C durante 1 h. Use 10 ml de solução de colagenase por rato filhote. </li><li> Misture delicadamente derme solução contendo cada 10 min. Verificar o grau de dissociação sob um microscópio, a suspensão de células deve ser digerido principalmente células individuais. A solução deve passar de claro a nublado comocélulas dérmicas são dissociados a partir da derme. </li><li> Adicionar a solução de colagenase FBS contendo derme para um volume final de 10% de redução da actividade da colagenase. </li><li> Passar a suspensão de células através de um coador de células 70 um para um tubo novo 50 ml para remover grandes aglomerações não digeridas e folículos inteiros. Adicionar 10 ml de DMEM/10% de FBS por 30 ml do fluxo através para diluir ainda mais a colagenase. </li><li> Tubos de centrífuga contendo derme digerida a 30 xg numa centrífuga de bancada durante 5 minutos para remover adicionalmente folículos inteiros. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo ml 50. Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células com FBS DMEM/10% (1 ml por pup) e contagem de células. Células da placa com Amniomax C-100 meios para a infecção (passo 7), ou para combinar com lentivírus infectadas KC-enxertos (passo 9). Rendimento típico é de 20 x 10 6 células por filhote. </li></ol> 6. Dissociar queratinócitos primários (KC) a partir de tecido triturada <ol><li> Dissociar KC incubando partes epidérmicas com recém-descongeladas 0,05% Tripsina-EDTA a 37 ° C durante 15 min. Use 7 ml de tripsina-EDTA, por ratinho pup. </li><li> Gentilmente solução redemoinho contendo epiderme a cada 5 minutos. </li><li> Adicionar um volume igual de solução de neutralização de Tripsina-EDTA contendo epiderme para reduzir a actividade da tripsina. </li><li> Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. Restante tecido não digerido deve flutuar em cima. </li><li> Verter cuidadosamente a maior parte do sobrenadante com o tecido não digerido. Remover o sobrenadante restante com uma pipeta de 10 ml sem perturbar pellet celular. Ressuspender pellet celular com PBS. No caso de KCS não são sedimentadas completamente, verter a maior parte do sobrenadante e repetir a centrifugação até que a maioria das células são sedimentadas. </li><li> Estirpe suspensão de células através do filtro 70 uM de células para um novo tubo para remover o tecido restante ou grumos. </li><li> Pellet células por centrifugaçãoa 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em CNT-07 mídia ou PBS (1 ml por filhote) e contagem de células. Use CNT-07 por células em placas para a infecção (passo 7), use PBS para combinar com lentivírus infectadas mDCs para enxerto (passo 9). Rendimento típico é 3-10 x 10 6 células por filhote. </li></ol> 7. Infectar células primárias com Lentivirus Contendo shRNA ou cDNA No dia da infecção dissecar outro conjunto de peles de rato para preparar frescos não tratados KCS primários ou MDCs para combinar com células infectadas por vírus no dia do enxerto (passo 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Para mDCs, placa de 4 x 10 6 mDCs por 10 cm de placa com Amniomax-C100 media e incubar a 37 ° C + 5% de CO2 para a infecção no dia seguinte a uma densidade celular de 50%. Placas geralmente 3-4 mDCs são usados ​​para gerar um enxerto, e um total de 10-12 placas são necessárias para gerar três enxertos em um experimento. Como alternativa, deixe mDCs anexar e espalhar fou um mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 e execute infecção no mesmo dia de plaqueamento das células. mDCs terá de fibroblastos-like morfologia. </li><li> Para KC, placa de 12 x 10 6 KC por 10 cm de placa com CNT-07 mídia e incubar a 37 ° C + 5% de CO 2 para a infecção pelo dia seguinte. Alternativamente, deixa KC anexar e espalhar por um período mínimo de 2 horas a 37 ° C + 5% de CO 2 e execute infecção no mesmo dia. Normalmente as placas 3-4 de KC são usados ​​para gerar um enxerto. Um total de 10-12 placas são necessários para gerar três enxertos para um experimento. KCS terá morfologia paralelepípedos. </li></ol></li><li> Pré-incubação de células de 5-10 min com 8 ug / ml Solução Polybrene a 37 ° C + 5% de CO 2. </li><li> Troca de mídia e adicionar lentivírus + 8 mg / ml solução Polybrene. Título Lentivirus irá variar dependendo da construção utilizada e deve ser determinado antes da infecção. </li><li> Centrifugar as placas a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 1 hora a 32 °; C para infectar células com lentivirus. </li><li> Remover lentivírus contendo mídia e adicionar novas mídias. Para KC, lavar as células uma vez com PBS antes de adicionar de volta novas mídias. As células normalmente infectadas recuperar durante a noite a 37 ° C + 5% de CO 2. Em alternativa, permitir que pelo menos duas horas de recuperação, a 37 ° C + 5% de CO2 antes de trypsinizing as células para enxertos. Continuar a cultura de uma pequena porção de células infectadas para verificar a eficiência de infecção, tal como descrito na secção de resultados representativos. </li></ol> 8. Prepare células infectadas para Enxertia <ol><li> Isolar frescos mDCs primárias ou KCS de pele usando os passos 4-6. Ressuspender as células em gelada PBS estéril. Contar as células. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para dérmica gene específico enxerto knockdown / superexpressão, dissociar mDCs infectadas a partir de placas com 0,05% Tripsina-EDTA a 37 ° C durante 8 min. </li><li> Para epidérmico gene específico enxerto knockdown / superexpressão, dissociar KC infectadas a partir de placas de using 0,125% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> Neutralizar a actividade de tripsina utilizando DMEM + 10% FBS (mDCs) ou solução neutralizante (KC). Transferir as células tripsinizadas em um tubo de 50 ml. </li><li> Células de pelotas por centrifugação a 200 xg numa centrifugadora de mesa, durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em gelada PBS estéril. Contar as células. </li><li> Reúne-se as células infectadas por vírus com o tipo de célula preparada de fresco não tratado correspondente. Por um enxerto, combinam 7-10 x 10 6 mDCs com 7-10 x 10 6 KCS em gelo PBS estéril e pellet a pasta de células numa centrífuga de bancada a 4 ° C. Ressuspender as células em 50 -100 ul gelada PBS estéril. Manter as células em gelo até câmaras nu / nu do mouse estão prontos. </li></ol> 9. Criar leito da ferida e da Câmara Fix nas costas de nu / nu Rato Um dia antes de enxertia, esterilizar instrumentos cirúrgicos com câmaras de silício autoclave e estéril por imersão em etanol 70%. Substitua o Etha de 70%nol com PBS estéril antes de usar as câmaras. <ol><li> Anesthetize nu / nu de rato (7-12 semanas de idade, sexo feminino) com cetamina (8 mg / ml) / xilazina (1,6 mg / ml) através de injecção intraperitoneal (100 g de peso corporal μl/10) ou outro método preferido. Aplique lubrificante ocular. Almofada de aquecimento sob lugar do mouse. </li><li> Desinfectar a pele volta nu mouse com iodo e limpar com álcool. </li><li> Adicionar 1-3 gotas Bupivicaine 0,25% a incisão topicamente. Aperte a pele de volta nu rato na base do pescoço com uma pinça. </li><li> Cortar um furo circular pequena (~ 1 cm de diâmetro) na pele presa com tesoura estéril. </li><li> Coloque câmara estéril em leito da ferida e cobrir as bordas da câmara com pele circundante. </li><li> Câmara seguro no lugar com suturas ao longo das arestas da câmara (6 pontos por câmara) como mostrado na Figura 2A. </li><li> Quando câmaras estão prontos, gentilmente pasta celular redemoinho e elaborar em 23 agulha de calibre ligado a uma seringa ml. Se lama celular foi condensado na parte inferior, suavementeressuspender com uma ponta de pipeta ml antes de desenhar na agulha. </li><li> Câmara de punção com agulhas e lentamente por gotejamento em células de feridas. </li><li> Camundongos colocar em gaiolas limpas, autoclavada. Casa 2 ratos por gaiola e adicionar antibióticos e Tylenol (3 mg / ml) para a água potável. Na nossa experiência, dois ratinhos fêmeas em cada gaiola não resultaram em trauma adverso para a câmara, enxerto, ou animais. </li><li> Coloque almofada de aquecimento sob o meia gaiola e observar ratos até anestesia desgasta fora. </li></ol> 10. Remover Câmara Após 7-9 dias <ol><li> Anestesiar chambered nu / nu rato como no passo 9.1. Aplique lubrificante ocular. </li><li> Desinfectar a pele ao redor da câmara com iodo e limpar com álcool. </li><li> Corte cuidadosamente e retire pontos da câmara. </li><li> Remova cuidadosamente câmara de mouse. Se varas novas da pele de enxerto para a câmara, retire parte da câmara e enxerto delicadamente separada da câmara usando uma pinça. Segurar enxerto para baixo durante a remoção da câmara. Enxerto deve look maçante e opaco como na figura 2B. </li><li> Aplicar uma camada não-aderente com uma fina película de antibióticos sobre o ferimento aberto e sutura no lugar (2 pontos). </li><li> Enrole atadura em torno do rato para fixar a almofada e proteger a ferida. Suturar bandagem no lugar. </li><li> As câmaras de silício são limpos por lavagem com sabão neutro e bem enxaguados com água deionizada. Mergulhe as câmaras em etanol a 70% durante a noite, o ar seco, e loja. </li></ol> 11. Examine Rato para o crescimento do cabelo <ol><li> Remover ataduras e almofada após 3 dias de remoção de câmara. Enxerto deve ser seco e opaco para na cor marrom. </li><li> Verifique periodicamente ratos para o crescimento do cabelo. O cabelo deve começar a mostrar menos 16 dias após enxerto. </li></ol> Esboço procedimento Dia 1 (2-3 hr): Sacrifica crias recém-nascidas, remover a pele, e deixar em dispase a 4 ° C durante a noite. Dia 2 (2-3 horas): isolar as células primárias da pele eplaca com uma densidade de célula recomendada. Dia 3 (3-4 horas): Infect células com lentivirus. Remover a pele a partir de um outro conjunto de crias recém-nascidas e deixar em dispase a 4 ° C durante a noite. Dia 4 (6-8 horas): isolar as células primárias de pele, contar e deixar no gelo. Recuperar as células infectadas com lentivírus por tripsinização e centrifugação, contar e combinar 7-10 x 10 6 células dérmicas e queratinocitos em 50-100 ul de PBS por enxerto. Criar leito da ferida no mouse, anexar câmara, e aplicar a mistura de células de ferir cama. Procedimento Alternativo Outlines Contornos procedimento alternativo irá reduzir o processo de quatro dias a três. <ol><li> Combinar Dia 1 e Dia 2, tratando peles de rato em dispase a 37 ° C durante uma hora (hr hora estimada 5-7). </li><li> Combinar o Dia 2 e Dia 3, infectando células com células em placas após o lentivírus de duas horas (tempo estimado hr 5-7). </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Ensaios de reconstituição de cabelo fornecer um modelo de regeneração único órgão para examinar o mecanismo de formação de folículo novo cabelo. Aqui, nós descrevemos um ensaio modificado câmara cabelo útil para determinar a função do gene na formação do folículo piloso. O nosso ensaio baseia-se no ensaio de reconstituição relatado câmara cabelo 5, 6,11, o que foi modificado para introduzir uma técnica de expressão lentiviral para alcançar sobre-expressão do gene ou knockdown em ambos os tipos de células dérmicas ou epidérmicas. O nosso ensaio proporciona uma alternativa rápida à geração específica de tecido nocaute genético. Este ensaio nos permite demonstrar a função dos genes na formação dos folículos pilosos em menos de três semanas de infectar células primárias com lentivírus para coleta de enxerto. O nosso ensaio pode ser alargado a interacções genéticas usando combinação shRNA / entrega cDNA por lentivírus em um tipo de célula 12, assim como permite o exame de sinalização entre o typ célula epidérmica e dérmicaes. O nosso ensaio o cabelo é mais adequado para a detecção de fenótipos fortes de ganho ou perda de função na regeneração do folículo piloso, enquanto que os defeitos subtis são mais difíceis de observar. Temos demonstrado com sucesso a função do gene dérmica específico de alguns genes com o nosso ensaio regeneração do cabelo 1,12. Com base no marcador GFP co-expressos a partir do vector de lentivírus expressando shRNA 10, demonstrou-se que o shRNA expressando células doadoras dérmicos persistiu nos enxertos de cabelo regenerados. GFP-positivas estavam presentes em células da papila dérmica (DP) dos folículos pilosos regenerada (Figura 3). As células DP provavelmente consistiam de diferentes níveis de knockdown do gene como células expressaram níveis variáveis ​​de GFP, assim o fenótipo do folículo de cabelo observada era uma gama de genética hypomorph como nulo. Uma melhoria para este ensaio será o de estabelecer uma seleção rápida e eficiente para as células que expressam shRNA alta antes grafting tal como a utilização de FACS para purificar fortes GFP-expressando células. Uma alternativa consiste em substituir as células mutantes knockout ou condicional neste ensaio 9. Por outro lado, um sistema de cultura que pode preservar a função da célula DP é muito útil como a potência DP é gradualmente perdido, uma vez que as células dérmicas primárias são passadas. Sistemas de cultura potenciais incluem o uso de biomateriais derivados de nicho artificial ou culturas de agregação 2,7,8,13. Outro melhoramento será gerar um método fiável de congelação de células da epiderme, com uma elevada taxa de recuperação de células, porque isto reduziria a utilização do segundo grupo de crias de rato (etapa 7) para gerar os queratinócitos frescas em dermo-específico perda ou ganho-de- estudos de função. Este ensaio cabelo câmara produz a densidade dos folículos pilosos e de qualidade semelhante à pele do rato normal, embora o crescimento do cabelo é um pouco menos sincronizados e orientação folículo é mais aleatória. Algumas limitações do ensaio de regeneração de cabelo genética include a exigência de grande quantidade de lentivírus e os números de células, e é um trabalho muito intensivo em termos de métodos cirúrgicos, quando comparada a outras formas de ensaios de reconstituição do cabelo, tais como o adesivo das abas e ensaios 3,4,14. No entanto, a qualidade dos folículos pilosos e linha de tempo para detectar o crescimento do cabelo é superior aos outros ensaios 4. Nosso ensaio regeneração alvo cabelo fornece um companheiro rápido e conveniente para os actuais modelos genéticos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> CNT-07 </td><td> Célula N Tec </td><td> CNT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase, Tipo 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultura de tecido </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Dissecando </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> curvada </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Abastecimento </td><td> GRF-2975 N º 10 </td><td> Sem tamanho. 10 </td></tr><tr><td> 70 stainer célula mM </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml tubo de centrífuga cónico </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Compressas com álcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de calibre 23 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Lubrificante ocular </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine cotonetes </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silício Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Bandagem flexível </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Não aderente vestir </td><td> Telfa </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materiais </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lave solução PBS 500 ug / ml Penicilina / Estreptomicina 12,5 ng / ml Fungizone 100 ug / ml de gentamicina Solução dispase HBSS 2,5 mg / ml final Dispase 100 ug / ml de gentamicina Mídia neutralizantes HBSS 15% (v / v) de FBS Solução de colagenase 0,25% (w / v) de colagenase, tipo 1 ONTEÚDO &quot;&gt; 100 ug / ml de Penicilina / Estreptomicina 2,5 ug / ml de Fungizone 50 ug / ml de gentamicina Solução Polybrene HBSS 8 ug / ml (w / v) Polybrene </td></tr></tbody></table>

rapid genetic analysis of epithelial-mesenchymal signaling during hair regeneration

Morfogénese do folículo de cabelo, um processo complexo que requer a interacção entre epitélios derivados de queratinócitos e o mesênquima subjacente, é um sistema de modelo atractivo para estudar o desenvolvimento de órgãos e tecidos específicos de sinalização. Embora o desenvolvimento de folículos do cabelo é geneticamente tractable análise rápida e reprodutível de factores essenciais para este processo continua a ser um desafio. Aqui descrevemos um procedimento para gerar superexpressão alvo ou shRNA mediada knockdown de factores utilizando lentivírus de um modo específico do tecido. Usando uma versão modificada de um modelo de regeneração do cabelo 5, 6, 11, pode-se atingir o ganho ou perda robusto de função de análise em queratinócitos de ratinho ou as células dérmicas primárias para facilitar o estudo de epitelial-mesenquimal as vias de sinalização que conduzem à morfogénese folículo piloso . Nós descrevemos como isolar frescos queratinócitos principal do mouse e células dérmicas, que contêm células da papila dérmica e seus precursores, entregar lentivírus containing ou shRNA ou cDNA para uma das populações de células, e as células se combinam para gerar folículos pilosos completamente formados nas costas de ratinhos nus. Esta abordagem permite a análise de tecido, os factores específicos necessários para gerar folículos capilares dentro de três semanas e proporciona um companheiro rápido e conveniente para os actuais modelos genéticos.

Na Figura 1 mostra o resultado de dermo-específico knockdown shRNA lentiviral de Smoothened (Smo), um componente crítico Shh sinalização, num enxerto de cabelo de 3 semanas de idade regenerativa. Os enxertos de controlo utilizando vector lentiviral sozinha mostra o crescimento do cabelo robusta (Figura 1A). Em contraste, por via cutânea específica knockdown de Smo resulta na perda do crescimento do cabelo (Figura 1B). Hematoxilina e eosina ilustra a fase de controlo de folículos pilosos e das condições experimentais (figura 1C, D). O fenótipo de crescimento do cabelo a partir de tratamentos semelhantes podem ser variáveis ​​entre experiências, incluindo o controlo positivo com infecção vector lentiviral sozinho. Enxertos de controle, portanto, positivas devem sempre ser incluídos em cada experiência como uma referência como 30% dos enxertos podem falhar como resultado de cicatrizes ou anexo incompleta de enxertos. No caso do teste de uma interacção entre dois factores, tais como overexpressing cDNA de um factor de rescue knockdown shRNA mediada de um outro fator, deve-se sempre incluem enxertos knockdown só para manifestar o resultado de perda de função em cada experimento. Isto irá fornecer um alcance necessário para determinar como um gene particular perturba o cabelo caminho de regeneração dos folículos e como dois genes interagem. Remoção da câmara (Figura 2A) deve ser feita com cuidado. O enxerto recém-formado deve ser ligeiramente opaco com uma superfície opaca (Figura 2B). O enxerto pode ficar para a câmara, tão suavemente levantando um lado é importante certificar-se o enxerto permanece presa ao leito da ferida. O enxerto é bastante estável depois de três dias e deve apresentar pouca dificuldade na remoção do penso. O crescimento do cabelo robusto devem ser observados depois de três semanas (Figura 2C). Omitindo quer mDCs ou KCS resultará num local da ferida recuperou sem pêlos (Figura 2D) 11. A morte celular ou perda de células num dostipos de células também resulta em nenhum cabelo, em contraste com a regeneração do cabelo reduzido em dermo-Smo knockdown, como mostrado na Figura 1B. Para assegurar um teste bem sucedido, é fundamental para conseguir mais do que 90% de infecção virai de células com sobre-expressão apropriada ou eficiência knockdown antes da enxertia. Devido às restrições de tempo do procedimento de enxertia, recomendamos resolução de problemas eficiências de infecção viral antes de iniciar a experiência do miocárdio, e sempre guardar uma pequena porção de células no dia da enxertia procedimento para verificar a perda ou ganho de expressão. Título Lentivirus irá variar dependendo da construção utilizada e deve ser determinado antes da infecção para alcançar eficiência 90-100%. Nós monitoramos eficiência de infecção viral com GFP coexpressas a partir do vetor lentivírus. Rotineiramente executar PCR quantitativo e / ou de transferência de Western para determinar a extensão do knockdown ou sobre-expressão. Utilizando dupla-expressão vetores com marcas fluorescentes para rotularAs células infectadas por vírus fornece uma maneira de comunicar perdurance de sinal e número de células que expressam as construções em enxertos maduros. Usamos GFP conduzida por um promotor de CMV a partir do vector lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 em combinação com Smo shRNA. Na Figura 3, mostramos um 3-semana enxerto dermo-específica antiga, onde GFP é lentivirally expresso em papila dérmica de um folículo piloso representante. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figura 1. A análise histológica do crescimento do folículo capilar. (A) Vista de controlo de regeneração do cabelo com enxerto de células dérmicas infectadas com vector lentiviral vazio e queratinócitos não tratados. (B) usando knockdown Smoothened shRNA lentiviral em células dérmicas combinada com resultados não tratados queratinócitos na perda dos folículos pilosos. (C) Hematoxilina e eosina mostra anágena f cabeloollicles em enxertos de controle de estender-se até a derme e (D) folículos pilosos Smoothened knockdown permanecer atrofiado e grande parte ausente. Todas as imagens têm três semanas depois do enxerto. Barra de escala indica 100 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figura 2. Enxertia células primárias. (A) rato nu / nu com suturadas câmara habitação principais células dérmicas e queratinócitos. (B) Remoção de câmara expõe recém-formado pele que é maçante e opaco no caráter. (C) cabelos totalmente crescidas sobre enxerto utilizando selvagem tipo primário células dérmicas e queratinocitos nas três semanas após o enxerto. (D) Adição de células primárias de queratinócitos da derme sem conduzir à ausência de cabelo depois de três semanas. Resultados semelhantes foram observados com a adição de queratinócitos primários sem células dérmicas. Figura 3. Manutenção da GFP expressão em papila dérmica. Imagens confocal papila dérmica de um 3-semana enxerto velho regenerado. GFP foi expressa na população de células dérmicas de um vector lentiviral e detectado na papila dérmica (verde). Versicam (vermelho) demarca a papila dérmica e núcleos foram etiqueta com Hoechst (azul). Nota GFP é expresso especificamente nas células da derme mas não nos queratinócitos circundantes. Barra de escala indica 20 um.

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Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Tissue-specific análise de um modelo de regeneração do cabelo folicular usando lentivírus para mediar o ganho ou perda de função.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

rapid-genetic-analysis-epithelial-mesenchymal-signaling-during-hair

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K visualizações.  Stanford University School of Medicine. Tissue-specific análise de um modelo de regeneração do cabelo folicular usando lentivírus para mediar o ganho ou perda de função.

Vídeo: Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Biologia

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

A abordagem inversa Genética para Teste de Redundância funcional durante a embriogênese

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Avaliar Propriedades Sinalização de Ectodérmica Epitélio Durante o Desenvolvimento Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análise rápida e Exploração de microscopia de fluorescência Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Uma nova técnica de Análise Quantitativa de perda de cabelo em ratos usando Análise Tons de Cinza

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...