3.5K Views
•
08:31 min
•
May 19th, 2022
DOI :
May 19th, 2022
•0:04
Introduction
1:04
Vascular Scaffold Fabrication
1:54
Granular Support Bath Preparation and Incorporation of Endothelial Cells and Support Cells with the Bioink
3:09
Bioprinting Microvascular Networks Using rhCollMA Bioink
6:00
Assembling the Bioprinted Microvascular Network with the Vascular Scaffold to Obtain the Engineered Vascularized Flap
7:12
Results: Representative Images of the Assembled Vascularized Flap
7:59
Conclusion
Transcript
Vårt protokoll gör det möjligt för forskare att generera hierarkiska kärlnätverk inom en fullt konstruerad och implanterbar flik, vilket banade väg för nya studier om blodkärlsbeteende under integration in vivo. Denna teknik kombinerade mångsidigheten hos två 3D-utskriftstekniker för att skapa och montera fartyg på mikro- och mesoskala som kan anastomoseras direkt med värdfartyg med hjälp av mikrokirurgi. Fullt konstruerade vaskulära klaffar kan användas för att behandla stora vävnadsdefekter samt för att ge en plattform för att studera vävnadsutveckling och integration.
De föreslagna metoderna kan utvidgas till att studera införlivandet av vävnadsspecifika celler, samt att utvärdera användningen av olika biobläck och stödmaterial. Börja med att fylla i BVOH-formen med 30 mikroliter av polymerlösningen. Centrifugera formen vid 100 gånger g i 2 minuter och fyll på formen med ytterligare 20 mikroliter av polymerlösningen för att säkerställa fullständig fyllning.
Frys de fyllda formarna vid minus 80 grader Celsius i minst 30 minuter för att säkerställa att all polymerlösning fryser. Ta bort lösningsmedlet från formarna genom att frystorka dem över natten. För att avlägsna offerformmaterialet, överför formarna efter frystorkningsprocessen till ett 5-liters avjoniserat vattenbad under försiktig omrörning.
Byt ut vattnet i badet när det blir grumligt. När all BVOH har lösts upp, lufttorka ställningarna och förvara dem i en vakuumkammare tills de används. Överför cirka 4 ml av det beredda, komprimerade stödmaterialet till varje brunn på en 12-brunnsplatta med en positiv förskjutningspipett.
Knacka på brunnsplattan på en hård yta för att tvinga stödmaterialet att sprida sig jämnt i brunnen. Förbered en suspension innehållande 2 miljoner HAMEC-ZsGreen och 6 miljoner tandmassastamceller i 10 ml endotelcellmedium. Centrifugera cellsuspensionen vid 200 gånger g i 4 minuter för att erhålla en cellpellets, aspirera sedan supernatantmediet och återsuspendera cellpelleten i 1 milliliter rhCollMA-biobläck för att erhålla ett biobläck med en total cellkoncentration på 8 miljoner celler per 1 milliliter biobläck.
Montera en nål med en inre diameter på 0,22 millimeter på en 3-milliliter bärnstensfärgad bläckpatron och placera patronen i ett 50 ml koniskt rör. Överför 1 ml av cell-biobläckblandningen till tryckpatronen genom att fylla den från toppen med en positiv förskjutningspipett för att minska bubblor. Installera skrivarkassetten i lämpligt verktyg på bioprintern.
Skissa ett 2D-mönster av en 4-millimeter kvadrat som innehåller en cirkulär kanal med en diameter på 2 millimeter i mitten. Extrudera skissen med 4 millimeter för att få en 4-millimeter kub med en central kanal. Exportera det här objektet som en STL-fil.
Importera en STL-mall med 12 brunnar till den solida modelleringsfliken i skivprogramvaran för bioprinter och placera den i det angivna området i den virtuella utskriftsbädden. Importera STL-filen för kubformen till den solida modelleringsfliken i skivprogramvaran för bioprinter. Klicka på kryssrutan Använd extern utsnitt följt av konfigurera utsnitt under objektegenskapsavsnittet.
I popup-fönstret väljer du ett rätlinjigt mönster för fyllningsmönstret och skriver 30% i fyllningstätheten, klicka på acceptera. Klicka på kuben och flytta den med musen för att placera en kopia av kubformen i varje önskad virtuell brunn. Klicka på knappen Lägg till material på materialfliken i skivprogramvaran för bioprinter för att skapa nya materialinställningar för rhCollMA-biobläck.
Välj materialinställningar för utskrift. För tryck, typ 2 psi och för hastighetstyp 20 millimeter per sekund i motsvarande lådor. Tilldela värdena för linjebredd och linjehöjd till 0,24 millimeter och accelerationsvärdet till 400 millimeter per kvadratsekund.
På den solida modelleringsfliken klickar du på kubobjektet och klickar sedan på rhCollMA-materialet från materialavsnittet för att tilldela det till kubformen. På fliken biomontering klickar du på knappen Skicka utskriftsjobb för att skicka utskriftsjobbet till bioprintern. Ladda utskriftspatronen laddad med det cellulära biobläcket i 3-milliliters omgivande pneumatiska dispenseringsverktyget i den 3D-extruderingsbaserade bioprintern.
Klicka på Cool-knappen under fliken Control Heating or Cooling på bioprinter-gränssnittsskärmen för att ställa in utskriftsbäddens temperatur till 4 grader Celsius. Ladda plattan med stödbadet på skrivarbädden. På fliken Skriv ut på bioprintergränssnittsskärmen klickar du på utskriftsjobbet och klickar sedan på Start, följt av GO för att starta utskriftsjobbet.
Efter utskrift, utsätt brunnsplattan för en 405-nanometer ljuskälla med en intensitet på 3 milliwatt per kvadratcentimeter i 30 sekunder för att initiera tvärbindningen av rhCollMA-biobläcket. Efter tvärbindning, inkubera brunnsplattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i minst 20 minuter tills allt stödbad smälter. Aspirera försiktigt det flytande stödbadet och ersätt det med endotelcellmediet.
Inkubera konstruktionerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Omedelbart efter avlägsnande av stödmaterial av det bioprintade mikrovaskulära nätverket, placera en fibronektinbelagd PLLA: PLGA vaskulär byggnadsställning bredvid den bioprintade strukturen. Sätt in kärlställningen i huvudkanalen för den bioprintade strukturen.
Inkubera de monterade konstruktionerna vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i två dagar. Förbered en cellsuspension av tdTomato-uttryckande humana fettmikrovaskulära endotelceller i en koncentration av 10 miljoner celler per milliliter. Placera en 20-mikroliter droppe av denna cellsuspension på en hydrofob yta.
Placera försiktigt kärlställningarna ovanpå droppen så att ställningens lumen i ena änden kommer i kontakt med celldroppen. Aspirera droppen från den motsatta änden av ställningen och fylla dess lumen med cellsuspensionen. Placera den sittande ställningen i ett mikrocentrifugrör och lägg den i en rotator inuti en fuktad inkubator i 60 minuter.
Slutligen överför ställningen till en 12-brunnsplatta och tillsätt 2 ml endotelcellmedium. Sidovyn av en representativ konstruerad flik avbildad fyra dagar efter endotelfodret på kärlställningen visas här. Den bioprintade mikrovaskulaturen visas i grönt, medan endotelfodret visas i rött.
Den representativa bilden visar anastomoserna mellan den bioprintade vaskulaturen och endotelfodret. Immunfärgning för glattmuskelaktin, kärnor och endotelceller efter sju dagars inkubation visas här. Den representativa bilden visar färdiga anastomoser av den konstruerade klaffen med en råttas lårbensartär före klämborttagningen och efter klämborttagningen.
Denna teknik kan användas för att studera mognad och integration av 3D-printad vaskulatur in vivo och övervaka perfusionen av implantatet i bakbenet för att fastställa potentialen och säkerheten för dess användning för att behandla vävnadsdefekter.
Konstruerade klaffar kräver ett integrerat funktionellt vaskulärt nätverk. I detta protokoll presenterar vi en metod för att tillverka en 3D-tryckt vävnadsflik innehållande ett hierarkiskt vaskulärt nätverk och dess direkta mikrokirurgiska anastomoser till råtta lårbensartär.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved