Neuro-inflammatie is een belangrijke speler bij verschillende neurologische aandoeningen. Daarom is het van groot belang om alternatieve in vivo neuro-inflammatiemodellen te onderzoeken en te ontwikkelen om studies van pathologische ontwikkeling te vergemakkelijken. De hier beschreven techniek is een uitstekend hulpmiddel om pathologische veranderingen in de hersenen beter te begrijpen via in vivo beeldvorming en voor het snel en efficiënt evalueren van mogelijke anti-neuro-inflammatoire geneesmiddelen.
Bereid je voor op de injectie door glazen haarvaten te trekken met behulp van een micropipettetrekker volgens het vijfstappenprotocol voor het trekken van glazen capillaire buisjes. Open de punt van de naald in een hoek tot de juiste grootte met behulp van een tang. Vul de naald met 0,1 milliliter minerale olie om ervoor te zorgen dat er geen bubbels zijn.
Verwijder de schroefdop van de stalen naald van het microinjectieapparaat. Lijn het glazen naaldgat uit met de stalen naald en draai vervolgens de schroefdop vast. Monteer het geladen naaldmicro-injectieapparaat in een micromanipulator.
Pas de positie van het microinjectieapparaat aan, zodat de micromanipulator het apparaat flexibel onder de microscoop kan verplaatsen. Ontlaad een geschikt volume paraffineolie dat nodig is om de stalen naald in de capillaire glazen buis te laten komen. Laat de injectieoplossing bestaande uit PBS of lipopolysaccharide op een glazen schuif gesteriliseerd met 70% ethanol vallen en pas het microinjectieapparaat aan zodat de punt in de vloeistofdruppel wordt ingebracht.
Laad ongeveer twee microliter injectieoplossing in de naald. Stel de micromanipulator zo in dat de naaldpunt van het microinjectieapparaat zich in hetzelfde gezichtsveld bevindt als de larven bij hoge vergroting. Smelt een oplossing van 2% agarose in dubbel gedestilleerd water met behulp van een magnetron.
Giet de gesmolten agarose in een plastic schaal. Gebruik een plastic transferpipet om de verdoofde larven naar het midden van een 2% agarose-gecoate plastic schaal te transporteren. Oriënteer de gemonteerde larven met de hersenkant naar boven voor toegang tot de naald.
Pas de vergroting van de microscoop aan zodat de hersenventrikelstructuur van zebravissen duidelijk wordt weergegeven in het gezichtsveld. Plaats de naald voorzichtig boven het hersentectum. Reinig het hersengebied met 70% ethanol en prik de huid van de hersenen van de zebravis langzaam door met de naaldpunt met behulp van de micromanipulator.
Druk op het voetpedaal om één nanoliter 1X PBS of verschillende concentraties lipopolysaccharide uit te werpen. Breng de larven onmiddellijk na de injectie over naar een schoon E3-medium. Verzamel na 24 uur de larven voor microscopische beeldvorming, locomotiefgedragstest en bepaling van andere indicatoren.
Bereid 1,5% low-melt agarose-oplossing in E3-medium en verwarm het in een magnetron om een heldere vloeistof te vormen. Gebruik een schone plastic transferpipet om de larven naar een glazen glijbaan te transporteren en verwijder zoveel mogelijk water. Gebruik een plastic transferpipet om een druppel van 1,5% low-melt agarose aan de larven toe te voegen.
Gebruik een naald van een milliliterspuit om de larven te oriënteren. Wacht tot de agarose afkoelt en stolt voordat u begint met beeldvorming. Ga 24 uur na lipopolysaccharide hersenventrikelinjectie verder met het bepalen van genexpressiemarkers.
Gebruik twee spuiten van één milliliter om de kopgedeelten van de larven te scheiden zonder het oog en de dooierzakgebieden. Homogeniseer het hoofdgedeelte met 200 microliter RNA-extractiereagens met behulp van een weefselslijper met 11.000 rotaties per minuut gedurende vijf seconden en voer vervolgens RNA-extractie uit met behulp van de chloroform-isopropanolmethode. Droog de RNA-pellet vijf tot 10 minuten aan de lucht en voeg vervolgens 30 microliter RNAse-vrij water toe om de RNA-pellet op te lossen.
Synthetiseer cDNA met behulp van reverse transcriptase met willekeurige primers zoals beschreven in het tekstmanuscript. Voer vervolgens real-time PCR uit op een qPCR-systeem met behulp van een in de handel verkrijgbare RT-qPCR-kit om de expressie van de doelgenen te bepalen. Breng 24 uur na lipopolysaccharide hersenventrikelinjectie de zebravislarven individueel over naar de putten van een vierkante microplaat met 96 putten.
Voeg 300 microliter E3-medium toe aan elke put en incubeer vervolgens de larven gedurende vier uur om te acclimatiseren aan de testplaat. Breng de door larven geladen microplaat over naar de volgdoos van de zebravis. Schakel de lichtbron in en incubeer de larven in de testbox gedurende 30 minuten om te acclimatiseren aan de omgeving.
Monitor en registreer het gedrag van de zebravis met behulp van een geautomatiseerd videovolgsysteem. Neem 12 sessies van elk vijf minuten op voor individuele zebravislarven en definieer de totale afstand zoals beschreven in het tekstmanuscript. Na behandeling gedurende 24 uur veroorzaakte één tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide ventriculaire herseninjectie een significant verlies van RA-neuronen in de hersenen van TgEtvmat2: GFP larvale zebravissen in vergelijking met de controle- en schijngroepen.
De transgene lijn elavl3:mCherry zebravis vertoonde significante veranderingen in de fluorescentie geïntegreerde dichtheid van larvale hersenneuronen wanneer geïnjecteerd met 2,5 tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide, terwijl de één milligram per milliliter lipopolysaccharide-injectie geen effect vertoonde. Verder veroorzaakte vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide een voortbewegingstekort en verminderde de totale afstand van zebravisbeweging gedurende een volgperiode van 60 minuten. De lachgasproductie en mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines in de kop van zebravislarven waren verhoogd op 2,5 tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharidebehandeling in vergelijking met de expressie in de controle- en schijngroepen.
De injectie van één tot vijf milligram per milliliter lipopolysaccharide toonde de rekrutering van neutrofielen in de larvale zebravishersenen, wat resulteerde in een significante toename van het aantal neutrofielen in het Tgmpo: eGFP zebravisbreingebied. De openingsgrootte van naalden en de hoeveelheid injectiekracht voor micro-injectie samen met de hoofdscheiding van de ogen en het lichaam van zebravissen is cruciaal voor deze procedure.
