이 기술은 인간 세포주 또는 일차 세포 집단에서 쉽게 설정할 수 있고 잘 조직된 골수와 유사한 구조의 특징을 제공하는 표준화된 시스템의 개발을 가능하게 합니다. 이 모델을 사용하면 고정 후 세포 수확을 통해 이미징을 통해 시스템 내 in situ 세포 위치를 특성화하거나 분자 또는 기능 연구를 위해 각 세포 구성 요소를 수집하기 위한 3D 구조 해리를 수행할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 보조 엔지니어 인 Kevin Geistlich입니다.
각 삽입물에 대해 35-40 밀리리터의 튜브에 1.5-1.5 밀리그램의 BCP 비드의 무게를 잰다. 즉, 바닥에 폴리 카보네이트 멤브레인이있는 작은 원통형 플라스틱 접시입니다. 오토클레이브 주기 동안 뚜껑이 열리지 않도록 1.5밀리리터 튜브의 상단을 통해 깨끗한 바늘로 작은 구멍을 뚫고 튜브를 닫힌 멸균 상자에 수직 위치에 놓습니다.
멸균된 폴리카보네이트 세포 배양 삽입물을 6-웰 플레이트의 웰 내에 넣는다. 멸균 BCP 비드를 1.5ml 튜브에서 인서트에 붓습니다. 인서트 내부에 350마이크로리터의 1X PBS를 떨어뜨려 비드를 조심스럽게 씻은 다음 4.5밀리리터의 1X PBS를 웰에 추가합니다.
팁을 우물 구석에 놓고 진공 또는 5 밀리리터 피펫을 사용하여 PBS를 버립니다. 세척 단계를 두 번 반복하십시오. 그런 다음 10% FBS가 보충된 1X PBS를 사용하여 시스템을 차단합니다.
조심스럽게 350 마이크로 리터의 블로킹 용액을 인서트에 넣고 4.5 밀리리터를 웰에 넣고 전체 플레이트를 인큐베이터에 밤새 두십시오. 시스템에서 차단 솔루션을 제거합니다. 혈관 및 중간엽 기질 세포 구획을 각각 나타내는 6개의 HMEC-1 세포에 10배 10 내지 10 및 혈관 및 중간엽 기질 세포 구획을 각각 나타내는 6개의 HS27A 세포를 15밀리리터 튜브에 1회 혼합하고 실온에서 5분 동안 원심분리한다.
상청액을 버리고 중간엽 기질 세포가 조골세포로 분화를 촉진하는 175마이크로리터의 ODM이 보충된 175마이크로리터의 HMEC-1 배지를 추가합니다. 350 마이크로리터의 세포 현탁액을 각각 삽입물 내부의 총 6개 세포에 10회 3회 붓는다. 그런 다음 세포가없는 결합 된 배지 4.5 밀리리터를 플레이트의 웰에 붓습니다.
혼합물을 부드럽게 흡인하고 1밀리리터 마이크로피펫으로 여러 번 분주하여 삽입물 내의 세포와 BCP 비드를 균질화합니다. 전체 혼합물이 인서트 바닥에 가라앉도록 합니다. 내피 및 중간엽 세포가 삽입물 내부에서 균질화되면 6웰 플레이트를 인큐베이터 내부에 3주 동안 보관합니다.
1밀리리터 마이크로피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 제거하고 인서트 모서리를 방해하지 않도록 팁을 내부 인서트 벽에 배치하여 일주일에 두 번 웰의 인서트 내부 유체를 교체합니다. 관심있는 혈액학적 세포를 HMEC-1 및 RPMI 조합 배지에 재현탁시키고 세포 현탁액을 삽입물에 첨가한다. 전용 배지를 갖는 관심있는 다른 셀 유형이 이 단계에서 추가될 수 있다.
약물 치료 프로토콜이 필요한 경우 관심 세포를 추가한 후 24시간 동안 기다렸다가 치료하여 뼈와 같은 구조에 부착할 시간을 줍니다. 일주일에 두 번 50%HMEC-1 완전 배지 및 50%RPMI 완전 배지로 배지를 새로 고칩니다. 일주일에 두 번 배양액을 교체한 후, 삽입물 내부에서 회수된 상청액을 영하 80도에서 보관하여 시스템 내 단백질 생산을 평가합니다.
3D 구조에서 세포를 분리하려면 4.5 밀리리터의 RPMI와 0.5 밀리리터의 FBS를 혼합하고 15 밀리리터 튜브에 0.4 밀리리터 당 콜라겐 분해 효소가 보충됩니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10 분 동안 용액을 따뜻하게합니다. 멸균된 6웰 플레이트 덮개에 삽입물을 거꾸로 놓아 멤브레인을 적절하게 잘라냅니다.
멸균 메스를 사용하여 측면에서 막을 절단하여 흰색 고체 디스크를 검색합니다. 이전에 준비한 용액 혼합물이 들어있는 따뜻한 15 밀리리터 튜브 안에 디스크를 넣으십시오. 튜브를 섭씨 37도 인큐베이터의 활성 휠에 놓고 소화가 가능하도록 10분 동안 배양합니다.
왜곡된 분석을 피하기 위해 모든 멤브레인에 동일한 배양 시간을 적용합니다. 배양 후, 15 밀리리터 튜브를 실온에서 1, 575 G에서 5 분 동안 원심 분리한다. 상청액을 버리고 펠릿을 따뜻한 1X PBS 5ml에 재현탁합니다.
펠릿을 300마이크로리터의 따뜻한 트립신에 재현탁하고 10초 동안 피펫팅하여 잘 섞은 다음 섭씨 37도로 설정된 수조에 1분 동안 넣습니다. 따뜻하고 순수한 FBS 1 밀리리터를 추가하여 효소 소화를 중단하십시오. 1 밀리리터 마이크로 피펫을 사용하여 매체를 기계적으로 흡입하고 분배하여 디스크를 완전히 해리시킵니다.
튜브를 1, 575 G에서 5 분 동안 원심 분리하고 10 % FBS가 보충 된 1X PBS 3 밀리리터에 펠릿을 재현 탁시킨다. 상청액을 수집하고 수집 튜브에 놓인 35 미크론 세포 스트레이너를 통해 여과하기 전에 비드를 5 초 동안 침전물에 두십시오. 회수된 여액을 1, 575 G에서 5분 동안 원심분리하고 트리판 블루로 세포를 계수하여 생존율을 평가하였다.
항체 혼합물에 펠릿을 재현탁하고 빛이 없는 얼음 위에서 30-40분 동안 배양합니다. 2%FBS가 보충된 PBS 1밀리리터를 첨가하여 세포를 세척하고, 유세포분석 분석을 개시 G.To 1, 575에서 5분 동안 원심분리하고, 회수된 펠릿을 10%FBS로 200 마이크로리터의 1X PBS에 재현탁시키고, 1 내지 2000 용액에서 DAPI로 보충한다. 텍스트 원고에 설명 된 매개 변수를 사용하여 세포 분석기의 튜브를 분석하십시오.
FSC-H 대 FSC-W 그래프 플롯을 사용하여 일중항 모집단을 게이트합니다. 일중항 분획에서 DAPI-A 대 FSC-A 그래프 플롯을 사용하여 생존 가능한 세포 집단을 확인합니다. 이전에 게이트된 DAPI 음성 모집단에서 APCA-A 대 FSC-A 그래프 플롯을 사용하여 CD45 양성 모집단을 결정합니다.
BM과 같은 구조를 고정하려면 기존 플레이트에서 1X PBS로 채워진 새 6웰 플레이트로 인서트를 옮깁니다. 그런 다음 인서트 내부의 배지를 1X PBS로 부드럽게 교체합니다. 인서트가 세척되면 새 6웰 플레이트 안에 넣고 웰과 인서트를 모두 새로 개봉한 파라포름알데히드로 채웁니다.
고정 과정이 빛에서 떨어진 실온에서 4 시간 동안 진행되도록하십시오. 그런 다음 1X PBS로 인서트를 한 번 세척하고 빛으로부터 섭씨 4도에서 보관하십시오. 원하는 노출 후, 결과는 생존 세포를 검색하기 전에 3D 모델 내에서 최소 6주 동안 혈액학적 세포를 유지할 수 있음을 시사했습니다.
이 3D BM 유사 모델에서 HS27A 세포주를 원발성 정상 골수 MSC 또는 급성 골수성 백혈병 MSC로 대체하거나 조혈 세포주를 1차 HSC로 대체할 수 있었습니다. 파라핀 임베딩 및 면역화학은 3D 모델을 사용하여 CD45 및 CD73 함량의 분석을 성공적으로 가능하게 했습니다. 이 3D 시스템은 3주간의 골수 유사 구조와 관심 세포에 대한 추가 시간이 필요합니다.
그리고 멸균 조건은 때때로 매주 두 번 매체 변경으로 매체 오염을 볼 수 있으므로 유지되어야합니다.
