기금은 국립 과학 재단 (MF)에 의해 제공됩니다.

소개 OMT는 &quot;가상 플륨 시뮬레이터&quot;를 통합할 수 있도록 설계된 자기 테더 시스템 [1]의 적응이다. 다음 프로토콜은 설명 방법을 제대로 테더 빠르다 (1 부)과 자석 (2 부) 및 질량 흐름 규제 악취 전달 시스템 (Part3)을 설정하는 전략을 제공합니다. 여기에서 설명한 내용이 특정 시스템에 최적화된이며 다른 기술 사양과 구성 요소에 따라 다를 수 있습니다. 1 부 : Tethering의 파리 여기에서 설명한 tethering에 대한 단계는 많은 이전의 연구와 유사합니다 [2]하지만, OMT에 사용하기 위해 적응 [3]. 적절한 tethering는 강력하고 반복적인 실험 실험을 보장하기 위해 중요합니다. 조심 tethering의 중요성은 overstated 수 없습니다. <ol><li> 4-6일 게시물 eclosion을 날아 수집 4~6시간 그들을 굶어. kimwipe은 탈수를 방지하기 위해 foodless 유리병에 물을 moistened 놓습니다. </li><li> 작은 유리병에 병에서 파리의 배치를 전송하고 섭씨 약 4도 정도에서 설정 펠티어 냉각 단계에서 황동 블록에 삽입. 적정 온도는 약 30 초 내에 파리를 anesthetizes. </li><li> 냉각 단계의 차가운 표면에 파리를 정렬하십시오. 젖은 Kimwipe은 표피에서 지속적인 냉각과 수분 위킹을 보장합니다. tethering에 대한 가장 큰 여자를 선택합니다. </li><li> 좋은 브러시를 사용하여 하나의 야생 타입 여성 과일 비행을 수용하기 위해 모양 사용자 지정 - 내장 관의 위치에 하나의 파리 밀어. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> 그림 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.</a> </li><li> 우리는 micromanipulator에 장착된 자석 막대와 minutien 핀 (벌금 과학 도구)를 위치. 핀은 무딘 끝이 단지 두 날개 사이에 머리 뒤에 지느러미 근육을 건드리면 이러한 정렬하는 것입니다. 머리에 눈을 향해 볼 때 핀 완벽하게 수직으로해야합니다. 파리와 핀 사이의 &#39;롤&#39;의 비록 작은 금액은 묵인할 수 없습니다. 핀과 신체의 긴 축 사이의 사이드 뷰 각도가 수평선 (그림 1)에 상대적인 30 도의 코를 접속 각도로해야합니다. 참고 : 자석 밧줄에 최적의 작업은 핀을 짧게 길이로 줄어들 수 할 수 있습니다. 이것은 서스펜션 자석 사이의 거리에 전적으로 달려 있습니다. </li><li> minutien 핀이 정렬되면, minutien 핀의 뭉툭한 끝에 UV - 활성 접착제 (ElectroLite 코프)의 작은 방울을 적용하는 얇은 강철 와이어를 사용합니다. </li><li> 접착제의 비말 그냥 머리 위의 파리의 흉부를 만지는 있도록 핀을 조작. 적절한 드롭 크기, 접착제 어닐링해야하며 흉부에 핀의 흐름. 너무 많은 접착제를 사용하지 않도록주의하십시오. </li><li> 자외선의 두 20초 파열로 접착제 치료. </li><li> 옆으로 고정 파리를 놓고 반복합니다. Kimwipe 작은 광장을 얇게하고 집게로 비행을 억제하기 위해 각 곁에 비행을 제공합니다. </li><li> 복구 한 시간 후, 닿는 파리 실험을 준비하고 있습니다. </li><li> 부적 절한 gluing는 자석 분야에서 수행하는 비행의 능력을 방해 수 있습니다. 모든 비행은 비행이 제대로 접착되도록하기 위해 모든 실험의 시작 원활한 회전을위한 확인하여야한다. 이것은 강한 optomotor 응답을 이끌어하기 위해 충분히 큰 공간 기간 줄무늬 패턴을 회전하여 수행할 수 있습니다 [4]. 비행이 잘못된 피치 각도로 접착하거나 롤 축에 대하여 핀에 졌다면, 즉시 수 있습니다 (I)하지 전혀 스핀하고, (ii) 운동의 제한 범위를 가지고, 또는 (iii) 일관성에 회전 속도. 위의 경우에는 즉시 폐기되어야하고 새로 교체. 이 문제를 해결하는 경우가 대부분 부적 절한 gluing의 경우되었습니다. (파리를 교체해도 문제가 해결되지 않으면, 부 2.4 참조) </li></ol> 2 부 : 자석 정렬 자석 (희토류 - magnets.com) 정렬하면 제대로 동작의 부드러운 360도 범위를 달성하기 위해 비행을 위해 필요합니다. 제대로 자석을 정렬하려면 다음 단계를 수행하십시오. <ol><li> 낮은 링 자석은 플라스틱 슬리브에 의해 수평으로 개최하고 맑은 진공 챔버 위에 직접 배치됩니다 (그림 1, 제 3의 자세한 설명). 위쪽 막대 자석은 낮은 자석 위에 수직으로 약 3 / 4 &quot;고정됩니다. </li><li> 대략 직접 낮은 고리 자석의 중앙 지점 위의 상단 막대 자석을 배치하여 시각 위턱과 아래턱에 자석을 맞춥니다. 괜찮아, 규모 조정 micromanipulator (시스키유 주)에 상단 자석을 첨부하는 데 유용합니다. </li><li> 에폭시는 상단 자석의 아래쪽 표면에 V - 보석 베어링 (소형 부품)는 회전 마찰을 최소화하고 비행 위치를 표준화합니다. </li><li> 경기장에서 비행기를 놓고 수평 및 V를 조정날 때까지 상단에 자석의 ertical 위치는 원활하고 꾸준히 편주 축에서 360도 회전시킬 수 있습니다. 모든 비행은 자석이 올바르게 정렬되고 개별 minutien의 핀이 (부 1.11 참조) 손상되지 않도록 모든 실험의 시작 원활한 회전을위한 확인하여야한다. 자석이 제대로 날아 있습니다 (I)하지 전혀 회전 정렬되지 않은 경우 (2) 운동의 제한 범위 (III)이 일치하지 판매율에서 회전합니다. 문제가 새로 비행을 대체하여 해결하는 경우, 그것은 (1 부 참조) 대부분 gluing 문제로 인해되었습니다. 이러한 문제는 모든 비행을 위해 존재한다면, 그것은 가능성 자석 추가적인 조정이 필요합니다의 정렬에 문제가 있습니다. </li><li> 경고 : 재미있을 수있는 희귀한 지구 자석과 함께 즐기면서, 그들은 매우 위험합니다. 손상된 장비 및 / 또는 가벼운 신체적 상해의 결과를 오용. 이러한 유혹 아직 쉽게 과소 평가 자석과 극단주의 운동. </li></ol> 파트 3 : 냄새 배달 <ol><li> 악취 전달 시스템이 이전에 설명한 하나를 기반으로 [5]하고 최적화하는 가장 힘든 부분은 (그림 1)입니다. 그것은 인내와 재판과 - 오류가 많이 필요합니다. 안정적인 냄새 추적을 달성하려면 다음 단계를 수행하십시오. </li><li> 악취 시스템의 초기 셋업은 사용자 정의 지어진 물 / 냄새 유리병에 가스 멀티플렉서 (사블 시스템 국제)에서 협궤 테플론 튜브 (소형 부품)를 실행해야합니다. 이러한 튜브의 콘센트는 동일한 테플론 튜브를 사용하여 피하 포트 튜브에 직접 연결됩니다. </li><li> 명확한 아크릴 진공 챔버는 자석을 지원하기 위해 무대 아래에 위치합니다. 우리는 비행을 가까이 개방 진공을 가지고 있으며 개방의 직경을 줄이기 위해 진공 챔버에 연결된 비행 아래 장착된 4mm 유리관을 사용합니다. </li><li> 포셉를 사용하여 무대에 닿는 파리를 놓습니다. </li><li> 매력적인 냄새 (애플 시더 식초가 잘 작동), 그리고 시각 비행은 그 냄새를 추적하는지 확인을 켭니다. 파리는 냄새에 대한 선호를 사용하지 않으려면 나타나는 경우, 다음 세 단계를 따르십시오. 이것은 몇 파리, 여러 시련을 요구할 수 있습니다. </li><li> 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 악취 포트의 위치를​​ 조정합니다. 우리는 파리의 머리에 냄새 micromanipulators에 포트 (시스키유 주)와 위치 4mm 지느러미와 3mm 앞쪽에를 탑재. </li><li> 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 질량 유량을 조정하십시오. 우리의 설정은 7ml/min (사블 시스템 국제 MFC - 4). </li><li> 파리는 냄새를 추적하기 위해 나타날 때까지 진공의 흐름 속도를 조정합니다. 우리는 흐름 레귤레이터 (콜 파머)를 사용 13l/min에서 진공 흐름 속도를 설정할 수 있습니다. 참고 : 빌딩 진공 공급 라인이 플륨 구조의 변화를 일으키는 시간이 지남에 따라 변동될 수 있습니다. 그것은 일정한 진공 흐름 조건에 대한 유량 조절기에 외부 진공 펌프를 연결하는 것이 유용할 수 있습니다. </li><li> 항구와 흐름 속도의 위치가 설정되면, 정기적으로 가스 멀티플렉서를 사용하여 전환을 사용하여 구현 물 증기 및 냄새의 증기 사이에 스위치와 시각 냄새가 때 비행은 그 냄새를 추적하는지 확인합니다. 때때로 그 냄새 포트 내부의 잔류 냄새 그 냄새가 꺼져 냄새 추적을 이끌어내는 수 있습니다. 이것은 에탄올과 피하 튜브를 작성하고 Kimwipe와 함께 배달 끝에 수집하여 제대로 위치 악취 포트를 제거하지 않고 제거하실 수 있습니다. 압축 공기를 사용하여 남아있는 에탄올을 날려와 실험을 재개. </li></ol> 대표 결과 : 다음 단계가 제대로 준수하면 두 가지가 관찰해야합니다. 첫째, 지속적인 회전 시각적 자극이 아래 OMT에 배치 닿는 파리가 원활하게 편주 축에서 360도 회전한다. &quot;손으로&quot;전환에 (saccades라고도 함) 지속적인 시각적 자극의 부재에서 자연 터닝 동작의 특징입니다. 파리는 분명히 원활하게 회전 수없는 경우, 부적 절한 gluing (1 부 참조)하고 고르지 자석이 (2 부 참조) 비난 수 있습니다. 둘째, 그 냄새가 켜져있을 때, 즉시 그 냄새의 방향으로 머리를해야합니다. 냄새가 해제되면 파리가 무대에 하나의 위치에 대한 설정을 자발적 saccade해야합니다. 파리 적극적으로 악취 플륨, 악취 포트의 위치, 공기 흐름 속도 및 / 또는 진공 흐름 속도를 추적하지 않는 경우 (파트 3 참조) 조정이 필요할 수 있습니다.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

파리 Tethering이 분야에서 안정적인 냄새 추적을 도출하는 것은 비교적 간단합니다. 그것은 연습, 인내와 시행 착오가 필요합니다. 이 분야의 많은 부분이 더욱 최적화된 또는 실험적인 잠재력에 변화를 얻을 수로 대체 수 있습니다. 예를 들어, 진공 챔버의 최신 버전이 훨씬 작은하며 무대 아래에 더 많은 공간을 허용합니다. 또한, 강도와 희토류 자석의 종류가 약간 변경될 수 있으며, 추가로 악취 포트는 냄새 유...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

그것은 곤충들이 바람 스트림의 제목을 안정화시키기 위해 시각적 단서를 사용하는 것이 여러 해 동안 명확되었습니다. 많은 동물이 바람에 실시 냄새를 추적할 수 있습니다. 맞바람의 등, 영상 안정화는 냄새 추적에 직접 에이즈 추적. 그러나 후각 신호를 직접 바람의 단서에서 독립적으로 시각 추적 행동에 영향을합니까? 또한, neurophysiology 및 Drosophila에서 후각의 neurobehavioral 유전학 연구의 최근 홍수가 훨씬 더 기술적으로 세련되고 양적 행동 assays 동기가있다. 여기, 우리는 원래 좁은 판상 흐름 냄새 plumes과 무대를 갖춘하여 시력 실험 고안 자기 테더 시스템을 수정했습니다. 비행기는 작은 강철 핀 접착하고 자유롭게 편주 수 있도록 자기 분야에서 일시 중지되었습니다. 작은 직경의 음식 냄새 plumes은 배고픈 파리로 안정적인 추적을 도출, 비행의 머리 아래로 이동합니다. 여기서 우리는 자석을 정렬 악취 플륨을 고안하고, 안정적인 냄새 추적을 확인, tethering의 중요한 역학에 중점을두고 있습니다.

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A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

여기 우리는 어떻게 밧줄 후각 자기 - 밧줄 (OMT) 기기에서 플라이를 설명합니다. 우리는 희토류 자석 및 악취 포트 및 최적의 냄새 추적을 달성하기 위해 자극 전달 및 진공 흡입 모두 질량 흐름 속도를 설정할 수를 정렬하는 방법에 대해 설명합니다.

Drosophila에서 Visual과 강한 중재 플라이트 컨트롤을 맡은 이후로 자기 테더 시스템

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

a-magnetic-tether-system-to-investigate-visual-olfactory-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K 조회수.  University of California, Los Angeles. 여기 우리는 어떻게 밧줄 후각 자기 - 밧줄 (OMT) 기기에서 플라이를 설명합니다. 우리는 희토류 자석 및 악취 포트 및 최적의 냄새 추적을 달성하기 위해 자극 전달 및 진공 흡입 모두 질량 흐름 속도를 설정할 수를 정렬하는 방법에 대해 설명합니다.

비디오: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila의 비행 중 시각 인한 악취 추적

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

연구

생물학

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

드로소필라의 온도 선호도 행동과 Circadian 리듬의 설계 및 분석

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

비행 성능의 정확하고 빠른 측정을위한 개선 된 방법에<em&gt; 초파리</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

마우스 모델의 유효성 검사는 세포 고유의 방식으로 LINC 단지를 방해

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...