우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.

참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용. </li><li> 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다. </li><li> 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다. </li></ol> 2. 문화 매체 준비 <ol><li> 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X). </li><li> 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다. </li><li> 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / 몰)를 추가합니다. </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 미디어를 자극 골수 대 식세포의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li><li> 파골 세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 추가 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / mol)의 </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 10 ng를 / ㎖에서 RANKL을 추가합니다. </li><li> 파골 세포 유도 매체의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 골수 격리 <ol><li> 한 C57BL / 6 마​​우스를 안락사경추 탈구이어서 이산화탄소 흡입 방법을 사용. 참고 : 설치류가 적절한 기술, 장비 및 에이전트를 사용하여 훈련받은 사람이 안락사해야합니다. </li><li> 위치 해부 보드에 마우스를 확보하고 70 % 알코올을 스프레이. </li><li> 대퇴골, 경골, 상완골 (humeri)과 척추를 해부하다. <ol><li> 앙와위에서 마우스로 시작합니다. 수직으로 하체를 따라 절개를하고 연부 조직 첨부 파일을 분할하여 대퇴골과 경골의 길이를 따라 절개로 시작합니다. 마지막으로, 골격에서 완전히 뼈를 확보하기 위해 무릎과 엉덩이 관절에서 뼈가 탈구. </li><li> 상완골을 분리하는 상지의 길이를 따라 절개를 진행합니다. 연부 조직 피막 첨부 파일을 해부하여 어깨와 팔꿈치 관절에서 상완골 탈구. </li><li> 마우스는 경향이있다 그래서 마지막으로, 위에 마우스를 켭니다. 정중선에서, 척추의 길이 방향을 따라 피부를 절개를. paravertebral 소프트를 관찰paravertebral 부드러운 조직 덩어리를 해부 척추의 뼈 가장자리를 따라 척추와 째다의 각면에 조직. 가위 사용하여 목의 기지에서 척추에 걸쳐 수평 절단을하고, 연부 조직의 첨부 파일에서 척추를 자유롭게 척추, 꼬리 삽입에 바로 인접의 끝에서. </li></ol></li><li> 뼈가 수확되면, 얼음에 FACS 버퍼에 보관하십시오. </li><li> 뼈에서 근육과 연부 조직을 청소하는 조직의 용지를 사용하십시오. </li><li> FACS 버퍼의 3 ㎖와 봉과 박격포로 청소 뼈를 놓습니다. </li><li> 봉과 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달하여 50 ML 원뿔 튜브에 피 묻은 액체 및 전송 대기음. </li><li> 5 ml의 FACS가 짓 눌린 뼈에 버퍼와 더 호감을 추가합니다. 다시 말하지만, 피펫을 사용하여 유체를 제거하고 70 μm의 스트레이너를 통해 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 뼈 트위어 호감신선한 FACS 완충액에서 세 번, 유체가 적색 착색되지 않을 때까지, 박격포와 유, 신선한 FACS 완충액 5 mL를 추가로 첨가 할 때마다 사용하는 가전. </li><li> 세포 펠렛을 수득 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 골수 용액을 원심 분리기. </li></ol> 골수 세포의 분리 4. 그라디언트 <ol><li> FACS 완충액 10ml에 상청에 resuspend 대기음 (RT로 유지). </li><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 (RT) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 타고. </li><li> 밀도 구배 세포 분리 매체로 골수 용액을 층을 포함한다. 천천히 전기 피펫을 사용하여이 작업을 수행합니다. 각 피펫 원뿔 튜브의 상단에있는 내부 표면에 대한 팁과 약 30 °의 원뿔형 튜브를 기울이십시오. 밀도 구배 세포 분리 매체를 방해하지 않도록 피펫에 느린 속도 설정을 사용하여 부드럽게 골수 용액 추방. 참고 : 궁극적으로있을 것이다두 솔루션 (휴대폰 솔루션 및 밀도 구배 세포 분리 미디어 솔루션) 사이의 명확한 정의합니다. </li><li> RT 원심 분리기를 사용하여, 15 분 동안 200 XG에서 평형 원심 밀도 구배 세포 분리 매체 및 세포 용액을 원심 분리기. 또한, 밀도 구배 세포 분리 미디어 구배를 사용하여 적절한 상분리되도록 원심 분리기에 가속 및 감속을 제거한다. </li><li> 원심 분리 후, 관심있는 골수 세포를 포함 흐린 중간층을 대기음. </li><li> 새로운 원뿔 튜브에이 세포를 전송합니다. 세포를 씻어 (얼음에 보관) 추가 FACS 버퍼의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 세포 펠렛을 얻었다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산을 허용하기 위해 미디어를 자극 식세포의 1 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 5. 셀 카운팅 <ol><li> 세포 용액 10 μl를 타고 혼합트리 판 블루 10 μL와. 로드 결과 믹스의 10 μL 혈구 상 및 솔루션 1 ㎖ 당 세포 수를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 20 만 셀을 추가합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 세포 도금 밀도는 파골 세포의 체외 배양에 적절한의 가장 중요한 요구 사항 중 하나입니다. </li><li> 조심스럽게 37 ° C에서 일반 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 선동. </li><li> 3 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오. </li><li> 대 식세포 자극 미디어 3 일 후, 파골 세포의 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 이하, 지점, 큰, 다핵 파골 세포가 배양 용기에 표시해야하는 5~7일, 매일 미디어를 변경합니다. </li></ol> 7. 염색 주석 산염 내성 산성 인산 가수 분해 효소 (TRAP) <ol><li> 체외 막 다른 5-7 일 후스트럭처는 물론 문화 미디어를 대기음. </li><li> 1X PBS로 3 회 부드럽게 우물을 씻으십시오. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정시키고 39 ° C에서 1 시간 방치. </li><li> 이 시간 동안, 37 ° C로 사전 온난화로 (시판) TRAP 염색을 준비합니다. </li><li> 파라 포름 알데히드에서 1 시간 후, 파라 포름 알데히드를 대기음 및 1X PBS로 부드럽게하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 미리 예열 TRAP 염색의 1 ML을 추가하는 것은 스테인드합니다. </li><li> 차광 1 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, TRAP 염색을 대기음. </li><li> 예열 탈 이온수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 1-2 분 길의 헤 마톡 실린 (주)와 잘 Counterstain과. </li><li> 명 시야 현미경을 사용하여 이미지 파골. </li><li> 얼룩의 적절한 색상 강도까지 탈 이온수로 우물을 씻어 핵 블루 나타나는 일반적으로 할 때, 달성전자. </li></ol> 8. 파골 세포의 흡수 분석 <ol><li> 뼈 기판 또는 무기 성 칼슘 포스페이트 코팅 중 미리 코팅 인 시판의 24 웰 폴리스티렌 배양 접시를 사용한다. </li><li> 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 2 단계의 단부에서 얻어진 200,000 갓 절연 골수 세포를 추가한다. </li><li> 부드럽게 3 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 전에 플레이트를 교반. </li><li> 3 일에서 파골 세포의 분화 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 5-7일에 대한 파골 세포의 분화 미디어와 매일 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 파골 세포의 흡수 활동 9. 정량화 <ol><li> 후술하는 바와 같이 광물 기판 파골 세포 분화 배지에서 체외 배양 5-7 일 후, resorpti 형성 파골 세포의 능력을 평가하기 위해, 광물 표면을 분석구덩이, 파골 세포의 활동의 지표에. </li><li> 재 흡수 분석 플레이트에서 대기음 미디어와 각 웰에 10 % 표백제 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 15 분 동안 10 % 표백제 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 증류수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 남아있는 물을 대기음 판에서 여분의 물을 흔들어 3-5 시간 동안 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> 시중에서 판매하는 폰 코사 염색 키트와 함께 접시 Counterstain과 해제 흡수 된 기판을 쉽게 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 흡수 된 표면의 대표 부품의 이미지를 취할 밝은 필드 현미경을 사용합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 파골 세포의 재 흡수 활성의 정량화를 허용하도록 흡수 된 표면의 백분율을 계산한다. </li></ol>

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저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.

쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다. 그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다....

뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응. 파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다. 체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 </s&gt;까지. 뼈 질량과 강도의 항상성 유지는 뼈 형성 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 증가함에 따라, 인간의 골 질환 11-13에서 파골 세포의 역할을 해독 할 기회가 더있다. 많은 변화가 9,12,14 설명과 파골 세포 배양 기술에 대한 다수의 프로토콜은 문학에 나타납니다. 싱 연구팀은 쥐의 골수 세포에서 osteoclastogenic 분석의 자신의 설명에, 아래에 설명 된 프로토콜과 유사한 방법을 설명합니다. 그러나 긴 뼈 수확 다음의 골수 세포를 분리, 싱 등. α-MEM 전체 미디어와 골수 캐비티를 플러시14. Catalfamo은 파골 세포 기능에 고혈당증의 효과를 검사하고있는 모든 세포가 골수 플러싱 동원하는 방법이되는 비 - 부착 세포는 12 폐기된다 가리, 24 시간 동안 배양 설명도 보일 등에 의해 사용되는 기술 . (9)이 사전에 발행 프로토콜은 하나의 뼈의 양 단부를 절단해야으로서도, 바늘 스틱 부상 귀중한 골수의 손실 위험을 도입 골수, 지루한 연습, 플러싱의 연습을 필요로한다. 우리가 설명 프로토콜은 Weischenfeldt 등에 의해 기술 된 대 식세포의 분리 방법과 유사한 파골 세포를 분리하기 박격포와 유의 사용을 구현한다. 15 우리의 경험은, 그러나, 종종 그 결과, 파골 세포 생산의 관점에서 가변 결과 이전에 출판 된 기법을 사용하여 그 결과 파골 분리 및 체외 배양이며무능력에서 파골 세포를 배양합니다. 따라서, 우리의 존재, 초기 식세포이어서 파골 세포 형성 도금 셀 70-80 %로 약 수율로 시험관 내에서 다핵 파골 세포의 다수 생산하는 마우스 골수의 일관된 분리를 허용하는 프로토콜을 고안 파골 세포 유도 매체.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> 파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다. 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다. ENT &quot;&gt; 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다. 여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

<html> 이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 ...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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23.9K 조회수.  Stanford University School of Medicine.  파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다. 