우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.

참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다. 1. 준비 <ol><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용. </li><li> 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다. </li><li> 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다. </li></ol> 2. 문화 매체 준비 <ol><li> 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X). </li><li> 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다. </li><li> 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / 몰)를 추가합니다. </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 미디어를 자극 골수 대 식세포의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li><li> 파골 세포 유도 매체를 준비합니다 <ol><li> 2.1 단계에서 제조 된 기저 미디어의 50 mL를 취하여. </li><li> 추가 10 -7 M 최종 농도에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2, 씨 352.465 g / mol)의 </li><li> 10ng의 / ㎖에서 대 식세포 - 콜로니 자극 인자 (M-CSF)를 추가한다. </li><li> 10 ng를 / ㎖에서 RANKL을 추가합니다. </li><li> 파골 세포 유도 매체의 최종 솔루션을 필터링하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 골수 격리 <ol><li> 한 C57BL / 6 마​​우스를 안락사경추 탈구이어서 이산화탄소 흡입 방법을 사용. 참고 : 설치류가 적절한 기술, 장비 및 에이전트를 사용하여 훈련받은 사람이 안락사해야합니다. </li><li> 위치 해부 보드에 마우스를 확보하고 70 % 알코올을 스프레이. </li><li> 대퇴골, 경골, 상완골 (humeri)과 척추를 해부하다. <ol><li> 앙와위에서 마우스로 시작합니다. 수직으로 하체를 따라 절개를하고 연부 조직 첨부 파일을 분할하여 대퇴골과 경골의 길이를 따라 절개로 시작합니다. 마지막으로, 골격에서 완전히 뼈를 확보하기 위해 무릎과 엉덩이 관절에서 뼈가 탈구. </li><li> 상완골을 분리하는 상지의 길이를 따라 절개를 진행합니다. 연부 조직 피막 첨부 파일을 해부하여 어깨와 팔꿈치 관절에서 상완골 탈구. </li><li> 마우스는 경향이있다 그래서 마지막으로, 위에 마우스를 켭니다. 정중선에서, 척추의 길이 방향을 따라 피부를 절개를. paravertebral 소프트를 관찰paravertebral 부드러운 조직 덩어리를 해부 척추의 뼈 가장자리를 따라 척추와 째다의 각면에 조직. 가위 사용하여 목의 기지에서 척추에 걸쳐 수평 절단을하고, 연부 조직의 첨부 파일에서 척추를 자유롭게 척추, 꼬리 삽입에 바로 인접의 끝에서. </li></ol></li><li> 뼈가 수확되면, 얼음에 FACS 버퍼에 보관하십시오. </li><li> 뼈에서 근육과 연부 조직을 청소하는 조직의 용지를 사용하십시오. </li><li> FACS 버퍼의 3 ㎖와 봉과 박격포로 청소 뼈를 놓습니다. </li><li> 봉과 박격포 부드럽게 뼈를 분쇄. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 솔루션을 전달하여 50 ML 원뿔 튜브에 피 묻은 액체 및 전송 대기음. </li><li> 5 ml의 FACS가 짓 눌린 뼈에 버퍼와 더 호감을 추가합니다. 다시 말하지만, 피펫을 사용하여 유체를 제거하고 70 μm의 스트레이너를 통해 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 일반적으로 뼈 트위어 호감신선한 FACS 완충액에서 세 번, 유체가 적색 착색되지 않을 때까지, 박격포와 유, 신선한 FACS 완충액 5 mL를 추가로 첨가 할 때마다 사용하는 가전. </li><li> 세포 펠렛을 수득 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에 골수 용액을 원심 분리기. </li></ol> 골수 세포의 분리 4. 그라디언트 <ol><li> FACS 완충액 10ml에 상청에 resuspend 대기음 (RT로 유지). </li><li> 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 (RT) 10 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브를 타고. </li><li> 밀도 구배 세포 분리 매체로 골수 용액을 층을 포함한다. 천천히 전기 피펫을 사용하여이 작업을 수행합니다. 각 피펫 원뿔 튜브의 상단에있는 내부 표면에 대한 팁과 약 30 °의 원뿔형 튜브를 기울이십시오. 밀도 구배 세포 분리 매체를 방해하지 않도록 피펫에 느린 속도 설정을 사용하여 부드럽게 골수 용액 추방. 참고 : 궁극적으로있을 것이다두 솔루션 (휴대폰 솔루션 및 밀도 구배 세포 분리 미디어 솔루션) 사이의 명확한 정의합니다. </li><li> RT 원심 분리기를 사용하여, 15 분 동안 200 XG에서 평형 원심 밀도 구배 세포 분리 매체 및 세포 용액을 원심 분리기. 또한, 밀도 구배 세포 분리 미디어 구배를 사용하여 적절한 상분리되도록 원심 분리기에 가속 및 감속을 제거한다. </li><li> 원심 분리 후, 관심있는 골수 세포를 포함 흐린 중간층을 대기음. </li><li> 새로운 원뿔 튜브에이 세포를 전송합니다. 세포를 씻어 (얼음에 보관) 추가 FACS 버퍼의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 세포 펠렛을 얻었다. </li><li> 혈구 세포를 사용하여 계산을 허용하기 위해 미디어를 자극 식세포의 1 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol> 5. 셀 카운팅 <ol><li> 세포 용액 10 μl를 타고 혼합트리 판 블루 10 μL와. 로드 결과 믹스의 10 μL 혈구 상 및 솔루션 1 ㎖ 당 세포 수를 얻을 수 있습니다. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> 24 웰 플레이트의 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 20 만 셀을 추가합니다. 참고 : 우리의 경험에 의하면, 세포 도금 밀도는 파골 세포의 체외 배양에 적절한의 가장 중요한 요구 사항 중 하나입니다. </li><li> 조심스럽게 37 ° C에서 일반 인큐베이터에서 플레이트와 장소를 선동. </li><li> 3 일 동안 미디어를 변경하지 마십시오. </li><li> 대 식세포 자극 미디어 3 일 후, 파골 세포의 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 이하, 지점, 큰, 다핵 파골 세포가 배양 용기에 표시해야하는 5~7일, 매일 미디어를 변경합니다. </li></ol> 7. 염색 주석 산염 내성 산성 인산 가수 분해 효소 (TRAP) <ol><li> 체외 막 다른 5-7 일 후스트럭처는 물론 문화 미디어를 대기음. </li><li> 1X PBS로 3 회 부드럽게 우물을 씻으십시오. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정시키고 39 ° C에서 1 시간 방치. </li><li> 이 시간 동안, 37 ° C로 사전 온난화로 (시판) TRAP 염색을 준비합니다. </li><li> 파라 포름 알데히드에서 1 시간 후, 파라 포름 알데히드를 대기음 및 1X PBS로 부드럽게하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 플레이트의 각 웰에 미리 예열 TRAP 염색의 1 ML을 추가하는 것은 스테인드합니다. </li><li> 차광 1 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 1 시간 후, TRAP 염색을 대기음. </li><li> 예열 탈 이온수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 1-2 분 길의 헤 마톡 실린 (주)와 잘 Counterstain과. </li><li> 명 시야 현미경을 사용하여 이미지 파골. </li><li> 얼룩의 적절한 색상 강도까지 탈 이온수로 우물을 씻어 핵 블루 나타나는 일반적으로 할 때, 달성전자. </li></ol> 8. 파골 세포의 흡수 분석 <ol><li> 뼈 기판 또는 무기 성 칼슘 포스페이트 코팅 중 미리 코팅 인 시판의 24 웰 폴리스티렌 배양 접시를 사용한다. </li><li> 각 웰에 대 식세포 자극 미디어 2 ㎖를 놓습니다. </li><li> 각 웰에 2 단계의 단부에서 얻어진 200,000 갓 절연 골수 세포를 추가한다. </li><li> 부드럽게 3 일 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치하기 전에 플레이트를 교반. </li><li> 3 일에서 파골 세포의 분화 미디어에 미디어를 변경합니다. </li><li> 5-7일에 대한 파골 세포의 분화 미디어와 매일 미디어 변경을 수행합니다. </li></ol> 파골 세포의 흡수 활동 9. 정량화 <ol><li> 후술하는 바와 같이 광물 기판 파골 세포 분화 배지에서 체외 배양 5-7 일 후, resorpti 형성 파골 세포의 능력을 평가하기 위해, 광물 표면을 분석구덩이, 파골 세포의 활동의 지표에. </li><li> 재 흡수 분석 플레이트에서 대기음 미디어와 각 웰에 10 % 표백제 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 15 분 동안 10 % 표백제 용액으로 세포를 인큐베이션. </li><li> 증류수로 우물 3 회 반복한다. </li><li> 남아있는 물을 대기음 판에서 여분의 물을 흔들어 3-5 시간 동안 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> 시중에서 판매하는 폰 코사 염색 키트와 함께 접시 Counterstain과 해제 흡수 된 기판을 쉽게 시각화 할 수 있습니다. </li><li> 흡수 된 표면의 대표 부품의 이미지를 취할 밝은 필드 현미경을 사용합니다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 파골 세포의 재 흡수 활성의 정량화를 허용하도록 흡수 된 표면의 백분율을 계산한다. </li></ol>

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저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.

쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다. 그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다....

뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응. 파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다. 체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 </s&gt;까지. 뼈 질량과 강도의 항상성 유지는 뼈 형성 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 증가함에 따라, 인간의 골 질환 11-13에서 파골 세포의 역할을 해독 할 기회가 더있다. 많은 변화가 9,12,14 설명과 파골 세포 배양 기술에 대한 다수의 프로토콜은 문학에 나타납니다. 싱 연구팀은 쥐의 골수 세포에서 osteoclastogenic 분석의 자신의 설명에, 아래에 설명 된 프로토콜과 유사한 방법을 설명합니다. 그러나 긴 뼈 수확 다음의 골수 세포를 분리, 싱 등. α-MEM 전체 미디어와 골수 캐비티를 플러시14. Catalfamo은 파골 세포 기능에 고혈당증의 효과를 검사하고있는 모든 세포가 골수 플러싱 동원하는 방법이되는 비 - 부착 세포는 12 폐기된다 가리, 24 시간 동안 배양 설명도 보일 등에 의해 사용되는 기술 . (9)이 사전에 발행 프로토콜은 하나의 뼈의 양 단부를 절단해야으로서도, 바늘 스틱 부상 귀중한 골수의 손실 위험을 도입 골수, 지루한 연습, 플러싱의 연습을 필요로한다. 우리가 설명 프로토콜은 Weischenfeldt 등에 의해 기술 된 대 식세포의 분리 방법과 유사한 파골 세포를 분리하기 박격포와 유의 사용을 구현한다. 15 우리의 경험은, 그러나, 종종 그 결과, 파골 세포 생산의 관점에서 가변 결과 이전에 출판 된 기법을 사용하여 그 결과 파골 분리 및 체외 배양이며무능력에서 파골 세포를 배양합니다. 따라서, 우리의 존재, 초기 식세포이어서 파골 세포 형성 도금 셀 70-80 %로 약 수율로 시험관 내에서 다핵 파골 세포의 다수 생산하는 마우스 골수의 일관된 분리를 허용하는 프로토콜을 고안 파골 세포 유도 매체.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> 파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다. 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다. ENT &quot;&gt; 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다. 여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

<html> 이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 ...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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Fibroblast Transformation and Muscle Stem Cells

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24.0K 조회수.  Stanford University School of Medicine.  파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다. 

비디오: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

골수 엽 성의 전구 물질에서 골수양 돌기 세포의 문화

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

골수에 조혈 세포의 유도

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Blastocysts에서 마우스 Trophoblast의 줄기 세포의 유도

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the proplatelet formation using in vitro-differentiated megakaryocytes; however, there is an increasing evidence that conventional culture systems do not faithfully recapitulate the differentiation/maturation process that takes places inside the bone marrow. In this manuscript, we present an explant method initially described in 1956 by Thi&#233;ry and Bessis to visualize megakaryocytes which have matured in their native environment, thus circumventing potential artifacts and misinterpretations. Fresh bone marrows are collected by flushing the femurs of mice, sliced into 0.5 mm cross sections, and placed in an incubation chamber at 37 &#176;C containing a physiological buffer. Megakaryocytes become gradually visible at the explant periphery and are observed up to 6 hours under an inverted microscope coupled to a video camera. Over time, megakaryocytes change their shape, with some cells having a spherical form and others developing thick extensions or extending many thin proplatelets with extensive branching. Both qualitative and quantitative investigations are carried out. This method has the advantage of being simple, reproducible, and fast as numerous megakaryocytes are present, and classically half of them form proplatelets in 6 hours compared to 4 days for cultured mouse megakaryocytes. In addition to the study of mutant mice, an interesting application of this method is the straightforward evaluation of the pharmacological agents on the proplatelet extension process, without interfering with the differentiation process that may occur in cultures.

Here, we detail the bone marrow explant method, from sample preparation to microscopic slide analysis, to evaluate the ability of megakaryocytes which have differentiated in their physiological environment to form proplatelets.

마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...