Denne protokollen beskriver en metode for å måle mekanisk kontroll av relaksasjon eller belastningsavhengigheten av muskelavslapping i hjertetrabekula. Den største fordelen med denne teknikken er at den fokuserer på hjerteavslapping. Gitt mangelen på behandlingsalternativer for diastoliske sykdommer, kan denne teknikken brukes til å identifisere nye indekser og legemiddelmål knyttet til hjerteavslapping.
Denne metoden vil bli vist med et gnagerhjerte, men den kan brukes på hvilken som helst intakt muskel. Demonstrere denne prosedyren vil være meg selv og Anita Abbo, en lavere forskningsassistent i laboratoriet mitt. For å begynne, fjern den grovt dissekerte smådyrmodellens hjerte fra kanylen og legg den i en silikonelastomerbelagt veieskål for å forberede seg på trabekulær isolasjon.
Deretter plasserer og belyser hjertet under et stereomikroskop. Etter å ha funnet den høyre ventrikulære utstrømningskanalen, fest venstre atrium og ventrikulær apex til silikonelastomeren i parabolen. Bruk lange Vannas saks, kutt fra høyre ventrikulær utstrømningskanal til toppunktet langs septum.
Deretter kuttes fra høyre ventrikulær utstrømningskanal til høyre atrium nær aorta, og kutt deretter gjennom høyre atrium. Bruk tang, trekk forsiktig opp den høyre ventrikulære frie veggen fra utstrømningskanalen uten å strekke vevet. Hvite tynne bindevevstråder, hvis de finnes, kan kuttes, men ikke de større rosa vevstrådene, da de kan være trabeculae.
Fest den frie veggen i høyre ventrikkeltrekant til parabolen for å eksponere høyre ventrikkel. Bruk en tynn, butt ende smeltet glasspipette, søk det eksponerte endokardiet for frittstående trabekler uten å påføre trykk. Unngå de trekantede papillære musklene og velg trabeculae med parallelle sider, som ofte finnes nær bunnen av høyre ventrikulær fri vegg og langs septum.
Dissekere trabecula ved hjelp av små Vannas saks, forlater en en millimeter-cubed stykke vev i hver ende av trabecula for å tillate vedlegg. Deretter kutter du omtrent to tommer av enden av en syv milliliter overføringspipette, trekker trabeculaen sakte inn i pipetten og overfører den til en ny veieskål som inneholder 50 % perfusjonsløsning og 50 % modifisert Tyrodes løsning. La muskelen balansere til økningen i ekstracellulært kalsium i den blandede løsningen I flere minutter.
Slå av pumpen som leverer superfusjon eller sug til eksperimentkammeret. Bruk den store overføringspipetten til å flytte trabekulaen inn i eksperimentkammeret fylt med Tyrodes løsning. Fest et kubet stykke vev på enden av trabeculaen til en krok på krafttransduseren, og fest deretter den andre kuben til motoren.
Start superfusjonen på nytt og begynn å pace muskelen for å bestemme terskelspenningen. Tempo på 20% over terskelspenningen i omtrent en time. På slutten av denne likevektsperioden, strekk sakte muskelen ved hjelp av mikrometeret som er koblet til motoren, til optimal utviklet stressgenerering oppnås ved å observere den utviklede spenningen.
Slutt å øke muskellengden når den passive diastoliske spenningen stiger raskere enn toppspenningen, noe som indikerer at den optimale lengden er passert. Slå av den overførte mikroskopbelysningen og belys trabekulaen ved hjelp av en svanehalsbelysning i bratt vinkel. Ved hjelp av et tidligere kalibrert kamera koblet gjennom mikroskotoptikken, ta et bilde av trabeculaen under diastolen inn i eksperimentell mappe.
Gjennomsnittlig diameteren måler og konverter diameteren og lengden fra piksler til millimeter ved hjelp av en tidligere oppnådd kalibrering. Beregn tverrsnittsarealet og muskellengden i mikrometer. I datainnsamlingsprogramvaren, skaff deg lastklemte data ved å definere etterbelastningen i dap-filen, og gjenta verdier av proporsjonale forsterknings- og integrasjonsparametere ved å lagre filen i tekstredigeringsprogrammet, og trykk deretter på Kjør eksperiment "i grensesnittet.
Kontroller enden av lastklemmen ved å endre modus. Gjenta anskaffelsen mens du endrer enden av lastklemmen fra null til fullført, og forleng tilbake til startlengden. For å øke lengden, øk gradvis terskelen for å avslutte belastningsklemmen fra null til muskelen nesten forlenges tilbake til sin opprinnelige lengde.
Hvis ønskelig, endre etterbelastningen og gjenta oppkjøpet umiddelbart. Hvis ønskelig, modifiser forspenningen ved å strekke eller forkorte muskelen, eller behandle muskelen ved å tilsette forbindelser til Tyrodes løsning, men vent minst 20 minutter for å sikre at den langsomme kraftresponsen har stabilisert seg og for at forbindelsen skal trenge helt inn i muskelen. Når datainnsamlingen er fullført, fjern trabeculaen og rengjør eksperimentsystemet.
Kvantifiser avspenning ved å sikre at dataanalyseprogrammet analyserer den klemte takten, og at programmet korrekt oppnår starten på lastklemmen. Etter å ha kvantifisert alle spor av en gitt tilstand, plott forholdet mellom avslapningshastigheten og belastningshastigheten, og begrens maksimumsdataene til en fysiologisk belastningshastighet på mindre enn en per sekund. Ekskluder data ved lave belastningshastigheter, da relaksasjonsfasen kanskje ikke gjenspeiler det eksponentielle henfallet.
Få hellingen på linjen mellom avslapningshastigheten og belastningshastigheten, og registrer hellingen som indeksen for mekanisk kontroll av avslapning. En enkelt hjertetrabekula opplyst ved hjelp av et svanehals LED-lys i en bratt vinkel på 75 grader fra mikroskoplinsens akse er vist her. Spenningstid og tøyningstidskurver for samme trabecula viste isometrisk rykning og tre belastningsklemmerykninger ved økende og systoliske belastningshastigheter.
Belastningshastigheten beregnes ut fra den deriverte av stammen like før isometrisk relaksasjon. Dataene er plottet på en avslapningsfrekvens versus belastningshastighetsgraf, hvor linjens helning gir mekanisk kontroll av avslapning, eller MCR-indeks. Den vanskeligste komponenten i denne protokollen er en forsiktig isolering av hjertetrabekulaen.
Denne protokollen kan kombineres med andre målinger av muskler, inkludert intracellulært kalsium, kontraktilitet og sarkomerlengde. Denne metoden brukes også til å identifisere molekylære mekanismer og bedre forstå patofysiologien ved nedsatt hjerteavslapping.
