Este modelo no solo se puede utilizar para explorar la patogénesis de la ACD, sino que también es aplicable para la evolución preclínica de nuevos métodos terapéuticos, que tiene un significado importante. Este es un modelo animal estable y eficiente con muchas ventajas, como un corto período experimental, fácil operación, síntomas obvios y una alta tasa de éxito. Nuestro protocolo experimental es muy detallado y fácil de operar.
Asegúrese de seguir cada paso del protocolo correctamente. Antes de comenzar el modelado, aclimatar a los ratones al medio ambiente durante una semana con acceso gratuito a alimentos y agua. El día del modelado, utilizando una lámpara ultravioleta y 75% de alcohol, limpie y desinfecte el ambiente y las encimeras.
Aplique agua jabonosa en el abdomen de los ratones con un hisopo de algodón y afeite el área en la dirección del crecimiento del vello con una cuchilla o afeitadora. Pesa el ratón y compara los cambios de peso entre cada grupo. Antes de realizar la estimulación de sensibilización abdominal, asegúrese de la recuperación completa de cualquier lesión menor en la piel del abdomen del ratón inducida por el afeitado.
Prepare una solución de DNFB al 0,5% y dilúyala con acetona a la mezcla de aceite de oliva en una proporción de 4 a 1. Con una pistola de pipetas, sople y mezcle 20 veces para mezclar bien la solución DNFB. Aplique 25 microlitros de la solución de DNFB al 0,5% sobre el centro del área de afeitado abdominal con un pipeteo, y extiéndalo ligeramente con el lado liso de la punta del pipeter para dispersarlo uniformemente.
Después de 30 segundos de estimulación DNFB, coloque el ratón en una jaula vacía sin ropa de cama para evitar que el ratón frote la solución de DNFB. Cuando la solución esté completamente seca, devuelva el ratón a su jaula original con acceso gratuito a alimentos y agua. Para la estimulación de la sensibilización del oído, oriente el cuerpo del ratón y haga que el borde exterior de la aurícula mire hacia abajo para evitar que la solución ingrese al canal auditivo durante la estimulación DNFB.
En los días 4 y 10, usando un pipeter, aplique 20 microlitros del vehículo, o solución de DNFB al 0,2% lenta y uniformemente a la superficie interna de la aurícula izquierda, y distribuya suavemente la solución usando el lado liso del pipeter. Deje el oído derecho sin tratar. Espere hasta que la solución DNFB esté seca y vuelva a colocar el ratón en la jaula.
Después de la estimulación de sensibilización abdominal y auditiva, pesar a los ratones cada dos días a partir del primer día. Compare el peso de cada ratón con el día cero y evalúe el efecto de ACD en el peso corporal de los ratones a medida que cambia el peso. Capture fotos de alta resolución de las orejas del ratón para registrar los síntomas clínicos de ACD cada dos días, a partir del primer día.
Usando calibradores vernier, mida el grosor de la aurícula a la misma hora cada día para obtener resultados precisos. Evite que las pinzas vernier continúen sujetando hacia adentro cuando haya un ligero bloqueo para evitar daños tisulares en la oreja del ratón. Mantenga la posición fija y registre los datos para ambos oídos.
Registre el promedio de los tres datos y evalúe la hinchazón del oído en micrómetros. Para evaluar el grado de inflamación inflamatoria en el día 11, prepare una solución de colorante Evans Blue al 0,5% y dilúyala con PBS. Para inmovilizar el mouse con un fijador, abra la tapa, sostenga la cola del mouse, haga que la cabeza del mouse mire hacia el fijador y permita que el mouse se suba instintivamente al fijador.
Cubra la tapa. Haga que la cola del ratón salga del orificio de la tapa y ajuste la longitud del fijador para exponer toda la cola del ratón. Limpie la cola repetidamente con una bola de algodón con alcohol, o sumérjala en agua tibia durante 30 segundos, y pellizque suavemente la raíz de la cola para rellenar, y expanda las venas en ambos lados.
Inyecte lentamente la solución de Evans Blue Dye en la vena de la cola del ratón utilizando una aguja de insulina de 1 mm bajo la irradiación de una fuente de luz fría. Espere 15 minutos para tomar fotografías de las orejas del ratón. Las orejas de ratón del grupo DNFB mostraron síntomas clínicos evidentes comparables a ACD, con áreas sensibles que muestran los síntomas típicos de enrojecimiento, sequedad, erosión y exudación.
Sin embargo, la administración en el oído de agua pura o control con disolventes no produjo ningún síntoma similar al grupo DNFB. En el grupo DNFB, en comparación con el oído derecho no tratado, el grosor del oído izquierdo aumentó significativamente después de la estimulación DNFB. No hubo diferencias significativas en los grupos control y de vehículos.
La oreja izquierda de los ratones del grupo DNFB se volvió azul oscuro después de la inyección del tinte Evans Blue, que era visualmente diferente de la oreja derecha. Las orejas izquierda y derecha de los ratones en los grupos de control y vehículos eran aproximadamente del mismo color. El aumento de peso del ratón se redujo ligeramente por DNFB, o estimulación simple del vehículo, pero no resultó en una pérdida de peso significativa.
La estimulación repetida de DNFB en el oído del ratón resultó en agrandamiento del bazo y un aumento en el índice del bazo. En contraste, el índice de bazo de los ratones en el grupo de vehículos no cambió significativamente. Asegúrese de que la solución de DINFB esté completamente mezclada y se aplique uniformemente a la oreja del ratón sin fluir hacia el canal auditivo.
Esta es la clave del éxito del modelado.
