El modelo de lodos cecales para la sepsis polimicrobiana es una poderosa herramienta para diseccionar la fisiopatología neonatal única. Puede ser variable y los puntos finales humanos no están bien descritos. Aquí presentamos nuestro procedimiento altamente estandarizado para preparar un purine cecal e inyectar en animales experimentales.
Además, utilizamos un enfoque basado en datos para identificar cachorros moribundos lo antes posible. Comencemos preparando un caldo de lodo cecal congelado. Esto se hace agrupando el cóncent cecal de al menos cinco ratones adultos, suspendiendo en agua dextrosa estéril, y almacenando en menos 80 para su uso posterior.
Puedes usar machos o hembras, pero el sexo, la edad y el fondo de los ratones para tus experimentos deben mantenerse constantes. Primero, preparemos nuestras herramientas para la disección. Estos incluyen un conjunto de tijeras y fórceps para la piel y un segundo conjunto para los órganos internos.
Encienda el esterilizador de perlas calientes al menos 30 minutos antes de su uso. Sumerja las herramientas en 70%etanol y luego sumerjalas en el esterilizador de cuentas calientes durante al menos un minuto. Rocíe una estera de toallas de papel con 70%etanol, luego retire las herramientas del esterilizador sin tocar la parte esterilizada de la herramienta a las manijas no estériles de otras herramientas.
Colóquelos en la toalla de papel para enfriar. Disecciona a los ratones en un armario de seguridad biológica. Ancle las patas del ratón a una tabla de espuma de poliestireno usando agujas de calibre 23 para que el ratón esté hacia arriba.
Rocíe el abdomen con 70%etanol. Usando fórceps y tijeras estériles, corta la piel del forro peritoneal con las tijeras y abre una región rectangular desde la ingle hasta el esternón y el lado izquierdo a derecho. Retire cualquier pelaje alrededor del peritoneo.
Cambie a un nuevo par de herramientas estériles para cortar a través del peritoneo, haciendo también una abertura rectangular. Identifique el cecum, que debe correr de izquierda a derecha a través del cuerpo. Interrumpir el tejido conectivo para identificar las ramas de cecum de los intestinos y cortar el cecum lejos de los intestinos.
Colóquelo en una hoja esterilizada de papel de pesaje. Usando herramientas estériles, cortar a través de ambos extremos del cecum. Sostenga el centro del cecum con fórceps y use una espátula plana de metal para empujar suavemente el contenido de la cecal fuera de los extremos usando un movimiento de rodadura.
Recoja el contenido y colóquelo en un tubo centrífuga de 15 mililitros prepesado. A la piscina de contenido cecal de un máximo de cinco ratones en el mismo tubo. Pondera el tubo de nuevo una vez que se ha añadido todo el contenido.
Para calcular el volumen de agua dextrosa para añadir al contenido de cecal en cada tubo, dividir el peso del contenido de cecal en el tubo por la concentración deseada en miligramos por mililitro. Mantenga una alícuota de agua dextrosa sobre hielo para la re-suspensión del contenido de cecal. Agregue la cantidad necesaria de agua dextrosa al tubo centrífuga de 15 mililitros que contiene contenido cecal.
Vórtice el tubo vertical y horizontalmente durante aproximadamente 30 segundos. Observar la presencia de partículas de más de unos pocos milímetros de diámetro, y si está presente, continuar vórtice hasta que todas las partículas hayan desaparecido visiblemente. Coloque un tubo centrífugo de 50 mililitros sobre hielo para recoger el filtrado e instale un colador celular estéril de 70 micrómetros sobre la parte superior.
Pipetear cuatro mililitros de lodos re-suspendidos de un tubo de 15 mililitros sobre el colador celular y en el tubo de recogida. Vuelva a suspender la partícula pipeteando hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces. Extruya suavemente las burbujas para aumentar la velocidad de filtrado mientras remueve el contenido con la punta de la pipeta hasta que no haya más líquido que se filtre.
Esto debería tardar aproximadamente 30 segundos. Cambie los coladores celulares entre cada tubo de lodo cecal, pero acamle todo el contenido en el mismo tubo de recolección de 50 mililitros. Si su stock supera los 40 mililitros, entonces vórtice durante 15 segundos, y coloque 20 mililitros en un nuevo tubo de centrífuga.
Divida la suspensión en viales criogénicos de 500 microlitros alícuotas cada uno. Vórtice la suspensión entre cada tres viales. Mantener el stock maestro en viales sobre hielo.
Al almacenar alícuotas en menos 80, la concentración de la unidad de formación de colonias aeróbicas en una preparación de lodos cecales no cambia durante un período de seis meses. Ahora que la suspensión cecal está preparada, podemos usarla para desafiar a una camada de ratones de siete a ocho días de edad con una dosis ajustada de peso de lodo cecal. La letalidad de la suspensión depende de la dosis.
Usted tendrá que determinar la dosis letal deseada en su instalación para cada nuevo stock con una nueva valoración de la dosis. Se prepara una alícuota de inyección de lodo cecal por camada. Normalizamos el inóculo a un volumen de 100 microlitros, redondeando a los 10 microlitros más cercanos para cada animal en la camada.
Preparar el desafío alícuota requiere tres cálculos, el volumen de stock de lodos requeridos, volumen adicional de agua dextrosa, y el volumen redondeado para cada cachorro en la camada. Los detalles sobre cómo realizar cada cálculo se pueden encontrar en la sección tres del protocolo. Realizar estos cálculos a mano para cada experimento puede llevar mucho tiempo y contribuirá al error experimental, por lo que se puede descargar una hoja de cálculo junto con el protocolo en el que se introduce la concentración de existencias, la dosis deseada y el peso de la camada, y la cantidad de stock de lodos, el volumen de agua dextrosa y el volumen real por cachorro se devuelve automáticamente.
Puede imprimir esta hoja y llevarla con usted cuando esté listo para desafiar a sus animales. Prepare la inyección alícuota en un armario de seguridad biológica y manténgala sobre hielo. Antes de cargar la jeringa, mezcle el tubo de microcentrífuga parpadeando 20 veces.
Los cachorros son desafiados con una jeringa de insulina de calibre 28. Antes de elaborar los purines, mezcle la alícuota inspirando y expulsando de 300 a 500 microlitros del desafío alícuota de entrada y salida del tubo de microcentrífuga. A continuación, elaborar aproximadamente 150 microlitros del desafío alícuota.
Esto debe ser mayor que el volumen de inyección para cualquier cachorro de siete a ocho días de edad. Deslice la jeringa para desalojar las burbujas del émbolo y retroceda ligeramente la jeringa para expulsar cualquier burbuja de aire. No toque la aguja ni el eje del émbolo durante este proceso.
Dispensar el exceso de lodo cecal de nuevo en el tubo de microcentrífuga hasta que la cantidad calculada de lodo cecal para el ratón se cargue en la jeringa. La suspensión cecal se administra con una inyección intraperitoneal. Realice esto de acuerdo con el protocolo de su institución de cuidado animal.
Para minimizar las fugas, incline al cachorro hacia abajo e inserte la aguja entre la pierna y los genitales, manteniendo la aguja superficial y subcutánea. Después de insertar la aguja alrededor de un centímetro, presione hacia abajo y hacia adelante hasta que sienta que la aguja perfora el peritoneo, luego presione lentamente el émbolo. Retire cuidadosamente la aguja siguiendo la misma ruta en la que entró, relajando el dedo medio mientras lo hace.
Tenga en cuenta cualquier fuga en su cuaderno de laboratorio y considere la posibilidad de omitir animales con fugas sustanciales de su resultado final. En esta sección describiremos los diferentes niveles de salud que observamos en ratones desafiados con sepsis polimicrobiana y su correspondiente punto final humano. Para cualquier procedimiento que involucre ratones neonatales, transferimos el material de la ropa de cama a una nueva jaula.
Esto transfiere el olor de la dama a sus guantes y reduce el estrés en la dama de la entrada repetida en su jaula. Hacemos un segundo nido en la nueva jaula para sostener a los cachorros monitoreados hasta el final del procedimiento o monitoreando cuando toda la camada está lista para ser devuelta a la jaula de la dama. Coloque un ratón sobre su espalda y monitoree la capacidad de la derecha dentro de cuatro segundos.
Si puede hacerlo bien, espere ocho segundos más para determinar el nivel de movilidad. Un ratón indiscutible o en recuperación es más a menudo capaz de a la derecha y explorar su entorno mediante la toma de varios pasos en una fila. Reagrupar ratones que son capaces de enredarse y tomar algunos pasos para explorar su entorno como aletargado por derechos.
Estos ratones pueden caerse mientras dan un paso y se ven temblorosos en sus pies. Un ratón que es incapaz de derecha y tiene movimiento de cadera que supera los 90 grados desde el horizontal que agrupamos como no a la derecha-móvil. Este ratón eventualmente se a la derecha, pero no puede en cuatro segundos.
Debido a sus movimientos de cadera, se agrupa como no a la derecha-móvil. Los cachorros que fueron incapaces de la derecha y tienen movimiento de la cadera por debajo de 90 grados de horizontal se agrupan como no pueden letarfargo a la derecha. Este es otro ejemplo de un ratón cuyas caderas no superan los 90 grados de horizontal y se agrupa como no a la derecha-letárgico.
Un cachorro que no esté en auto-no móvil tendrá piernas que pueden sacudirse o vibrar pero no tienen movimiento de cadera. Las extremidades pueden extenderse y retraerse, pero no tendrán movimiento lateral. El cachorro está visiblemente enfermo y ha llegado al punto final humano.
Este es otro ejemplo de un cachorro que no puede ser no móvil. Sus caderas no se agitan de izquierda a derecha, pero sus patas vibran. Cuando se maneja la jaula de la dama, los cachorros pueden ser arrastrados fuera del nido si la dama de la enfermería corre.
Los reemplazamos y luego buscamos otros cachorros dispersos que estén lejos de sus compañeros de nido. Si esos cachorros dispersos no se dejan letarhargic, están en un punto final humano. Aquí hay una curva de supervivencia Kaplan-Meier de nuestro modelo de sepsis.
Los puntos de tiempo de monitoreo se pueden encontrar en el SOP adjunto. En cualquier punto a lo largo de la curva de supervivencia si se encuentra que un ratón no puede no ser a la derecha-no móvil, está en su punto final humano y eutanizado. Entre 12 y 21 horas después del desafío, los ratones aparecerán enfermos y aproximadamente la mitad de los ratones podrán hacerlo justo en un lado, mientras que la otra mitad no se ate en cualquiera de sus lados.
Este es el período de tiempo en el que los ratones comenzarán a divagar en la puntuación de salud y alcanzar el punto final humano de no hacer el derecho-no móvil. Estos son resultados representativos de las puntuaciones de salud observadas en este período de tiempo. Los grupos de sobrevivientes y no sobrevivientes no se pueden diferenciar en este punto en función de sus puntuaciones de salud.
En esta etapa de la enfermedad, de 21 a 48 horas después del desafío, observamos la mayor proporción de variables humanas. También hemos observado que la gran mayoría de los ratones que son incapaces de endar en ambos lados no terminarán recuperándose de la enfermedad, lo que se convierte en un nuevo criterio para la variable humana, además de los criterios de no hacerlo a la derecha-no móvil. Las puntuaciones de salud observadas durante esta etapa de la enfermedad dieron lugar a una separación de sobrevivientes de no sobrevivientes.
La gran mayoría de los ratones que no pudieron hacerlo a ambos lados no se recuperaron de la enfermedad. Estos datos admiten que un nuevo criterio para una variable humana a partir de las 21 horas después del desafío debe ser eutanasiar a los ratones que no estén a la derecha en ambos lados. Durante 48 horas después del desafío muchos ratones comenzarán a mostrar más actividad y un mejor reflejo de correcta.
A pesar de que la proporción de variables humanas es menor en este período, los ratones todavía pueden divagar y enfermarse, y todavía requieren monitoreo para la variable humana. Durante este período de tiempo, algunos de esos ratones que finalmente se agruparon como no supervivientes habían mostrado un aumento de la actividad en un momento, pero más tarde lo hicieron peor y alcanzaron un punto final humano. Esto requiere un monitoreo continuo de los animales enfermos con mayor frecuencia si comienzan a mostrar peores resultados de salud.
Los experimentadores independientes que no han recibido entrenamiento en persona y que sólo observan este video instructivo fueron probados en su capacidad de asignar la misma puntuación que los investigadores usando videos de prueba grabados. Este video instructivo da como resultado una clasificación del comportamiento precisa. La capacidad de asignar la puntuación correcta para no hacerlo a los ratones neonatales no móviles, que es una medida de la variable humana, se determinó de 60 ratones neonatales, y un promedio del 97% de los comportamientos se distinguieron con precisión, con sólo el 3% identificado erróneamente.
A continuación, se probó la capacidad de diferenciar los ratones neonatales que no tenían razón o que eran capaces de hacerlo en cuatro segundos. Esta es otra medida de la variable humana y fue asignada con precisión en el 97% de los ratones neonatales, mientras que el 3% de los cachorros fueron asignados incorrectamente como correctores. Aquí hay resultados representativos para el porcentaje de cambio de peso de los ratones en comparación con su tiempo de desafío.
El cambio de peso promedio entre sobrevivientes y no sobrevivientes comenzó a separarse a las 24 horas después del desafío, pero hay mucha superposición entre los grupos. Hubo algunos sobrevivientes que perdieron más del 20% de peso pero todavía se recuperaron de la enfermedad. El cambio de peso no fue tan eficiente en la predicción de resultados en comparación con las diferencias en las puntuaciones de salud, razón por la cual no se utiliza como criterio para determinar si los ratones están en un punto de vista humano.
Para concluir, ahora debería ser capaz de preparar un stock de lodos cecales congelados, calcular la dosis ajustada por peso. E inyecte y monitoree ratones recién nacidos para obtener puntos finales humanos. Esperamos que este sea un recurso valioso para su investigación de ratón.
