Queremos expresar nuestra gratitud a los empleados del Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de la Universidad Estatal de Iowa, a saber, Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green y Jennifer Groeltz-Thrush, por el procesamiento oportuno de las muestras. También nos gustaría agradecer a Jodi Smith y Bethann Valentine por proporcionar material para los experimentos de permeabilidad. También queremos agradecer a David Díaz-Reganon por su ayuda con la Figura 9. A excepción de la Figura 6, todas las figuras se crearon en BioRender.com. Los autores desean agradecer el apoyo de la Startup de la Facultad, el Premio ISU VPR Miller, el Premio ISU VPR Miller y el premio NSF SBIR a ISU # 1912948.

K. Allenspach es cofundador de LifEngine Animal Health y 3D Health Solutions. Se desempeña como consultora para Ceva Animal Health, Bioibérica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics y Mars. J.P. Mochel es cofundador de LifEngine Animal Health y 3D Health Solutions y se desempeña como consultor para Ceva Animal Health y Ethos Animal Health. Este artículo refleja los puntos de vista de los autores y no debe interpretarse como que representa el respaldo, la opinión o las políticas de la Administración de Alimentos y Medicamentos. Otros autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Los cultivos de organoides intestinales caninos en el aparato de soporte permeable son un concepto único que conecta los ensayos tradicionales de permeabilidad a fármacos40 con un novedoso modelo canino in vitro 41. Se pueden usar y evaluar diferentes tipos de organoides intestinales caninos en función del objetivo del experimento con ajustes mínimos. Se recomienda probar múltiples concentraciones del fármaco de interés en 3-4 pocillos por grupo. Las concentraciones pueden basarse en la concentración intestinal esperada de la droga. Además, el uso de investigaciones previas puede ayudar a determinar los puntos de tiempo apropiados para el diseño del estudio. Se debe hacer la documentación adecuada del diseño del estudio para aumentar la replicabilidad y ayudar en la solución de problemas.
Esta tecnología tiene varias limitaciones debido a la novedad del método42, principalmente debido a la falta de estandarización en el diseño experimental y la ejecución del protocolo en todos los laboratorios. Esta falta de estandarización ha sido reconocida por otros grupos43, y los Protocolos De Monocapa Organoide 3D Canina conducirán a la reproducibilidad entre laboratorios e introducirán la estandarización a este sistema. Los enfoques estandarizados para el análisis de datos mejoran la replicabilidad y pueden fortalecer los resultados de las pruebas preliminares de drogas utilizando los organoides caninos en el sistema de soportes permeables en diferentes laboratorios. El modelo organoide 3D canino también carece de conjuntos de datos que comparen los valores in vitro de Papp de los medicamentos modelo con su absorción intestinal in vivo humana o canina conocida, al igual que las células Caco-2 44,45,46. Una vez que se han generado dichos datos, este modelo de organoides caninos se puede utilizar para evaluar la permeabilidad intestinal durante el desarrollo del fármaco.
Es crucial que se tenga cuidado al sembrar los organoides en el sistema de soporte permeable para sembrar una densidad lo suficientemente alta de células adecuadamente disociadas. Los valores TEER del sistema son más fiables y reproducibles cuando se cultivan en monocapas estrictas. El cultivo prolongado de las monocapas puede conducir a un aumento exponencial de los valores de TEER que se alejan más de los valores fisiológicos del intestino. Las secciones de H&E de tales estructuras 3D muestran varias capas de células una encima de la otra con estructuras alteradas de enterocitos más cerca de la membrana.
Después de la expansión exitosa de la monocapa organoide intestinal canina, los resultados se pueden analizar de la misma manera que los ensayos tradicionales de células 2D mediante el cálculo del coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) de un fármaco fórmula44. El valorde la aplicación P (véase Eq (2)) describe la velocidad de transporte a través de la monocapa celular47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Es <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> la pendiente inicial de la concentración frente a la curva de tiempo (por ejemplo, nmol/s). A es el área del inserto (cm2), y C0 es la concentración inicial del fármaco o compuesto en la cámara donante37. El reconocimiento confiable de la integridad de la monocapa es una parte crucial del ensayo de permeabilidad que requiere estandarización. Se recomiendan mediciones de microscopía de luz y TEER para evaluar organoides caninos en un sistema de soporte permeable y ayudar a determinar el momento correcto del experimento. Además, se pueden utilizar marcadores de permeabilidad molecular cero (por ejemplo, FITC-dextrano, amarillo Lucifer, PEG-400) para evaluar funcionalmente la integridad de la monocapa organoide. Se debe prestar atención si el compuesto probado se ve afectado por un transportador. La glicoproteína P (P-gp) se utiliza como un ejemplo común de bomba de eflujo. Se debe generar una relación de eflujo (aplicación P, aplicación BL-AP / P, AP-BL) con comparación con un sustrato de sonda P-gp bien conocido.
La microscopía de luz (simple o mejorada con contraste de fase) es un método invaluable para verificar la integridad de la monocapa 2D o 3D y el inserto del filtro mientras se evalúa el posible crecimiento excesivo celular. La Figura 7 puede servir como una guía para reconocer cultivos sanos de células organoides intestinales caninas. Los valores de TEER son una medida importante de la formación de uniones intercelulares y la diferenciación de los cultivos de organoides en un epitelio intestinal intacto. Los organoides intestinales caninos se diferencian en enterocitos y células caliciformes (Figura 6). Estas células productoras de moco permiten el estudio de las interacciones fármaco-moco, lo que ha sido difícil de lograr utilizando cultivos celulares 2D tradicionales48. La presencia de células enteroendocrinas ha sido confirmada previamente en organoides intestinales caninos por Chandra et al.33.
Se proporciona una caracterización adicional de las monocapas organoides caninas derivadas de organoides yeyunales, ileales y colónicos utilizando TEM. Las imágenes TEM muestran la microarquitectura celular, incluidas las uniones estrechas y la formación de microvellosidades, lo que ilustra aún más la complejidad y la utilidad de estos modelos organoides en medicina traslacional. Con base en los resultados experimentales, los cultivos de organoides en el soporte permeable estuvieron listos para la experimentación entre los días 11 y 13 después de la siembra (Figura 9). Los valores de TEER en este punto de tiempo oscilaron entre 1.500 y 2.500 Ω.cm2. La fase de meseta de los valores TEER dura una ventana de tiempo muy limitada en la que el experimento debe iniciarse antes de que los valores TEER comiencen a disminuir lentamente. Los valores de TEER también pueden ser una parte crucial de la visualización de resultados experimentales importantes, ya que algunos medicamentos o excipientes de productos farmacéuticos pueden interactuar con la monocapa (por ejemplo, uniones estrechas), lo que puede afectar en gran medida las lecturas de valores de TEER. Esto por sí solo puede servir como datos para un experimento.
Los organoides intestinales caninos en un aparato de cultivo celular de doble cámara se pueden aplicar en campos distintos de la permeabilidad oral a los medicamentos debido a la arquitectura única de la monocapa celular resultante. Por ejemplo, se pueden utilizar en la investigación microbiológica (por ejemplo, el impacto de la alteración de la flora microbiana gastrointestinal), estudios de absorción viral, interacciones fármaco-fármaco y mecanismos de transporte de fármacos49. La cámara donante generalmente se llena con el medicamento de prueba o compuesto de elección, y las alícuotas de la cámara receptora se toman en varios puntos de tiempo. Estas alícuotas se pueden analizar utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento, espectrometría de masas, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas u otras técnicas para determinar la cantidad y la velocidad por la cual el soluto penetra a través de la monocapa.
Estos estudios requieren una monocapa intacta para evaluar la permeabilidad del fármaco con precisión. Esto generalmente requiere el cultivo de monocapas en exceso de las necesarias para dar cuenta de los pozos inutilizables. Las monocapas de células organoides también se pueden usar para medir la absorción viral, ya sea desde el lado apical o basal de una monocapa, con lecturas que incluyen ensayos de inmunofluorescencia que utilizan anticuerpos para detectar la absorción celular del virus. Finalmente, se pueden aplicar múltiples medicamentos (es decir, sustrato e inhibidor) a la cámara donante para identificar las interacciones medicamentosas basadas en transportadores.
Sobre la base de las observaciones actuales, estos métodos no solo serán aplicables a los organoides caninos en insertos de cultivo, sino que también serán adecuados para otras especies veterinarias y sistemas de órganos, con modificaciones menores necesarias para adaptarse mejor a la especie o modelo de órgano de elección. Los protocolos para el crecimiento de organoides intestinales caninos tuvieron que ajustarse en función de las propiedades únicas del cultivo. Por lo tanto, el protocolo se puede ajustar a otra especie, pero requerirá cambios sutiles en el protocolo. Las modificaciones pueden comenzar con cambios en la densidad de siembra celular y expandirse a cambios en la composición de los medios para diferenciar adecuadamente los organoides de interés.
La estandarización, la documentación detallada de los procedimientos experimentales y el monitoreo consistente de las monocapas celulares son prácticas cruciales necesarias en los ensayos de soporte permeable y no se limitan al sistema canino. Estas posibles modificaciones de especies u órganos son fundamentales para documentar e informar sobre nuevos avances en el campo. Este modelo tiene varias limitaciones, por ejemplo, sus requisitos de costos, la variabilidad entre laboratorios y los datos limitados sobre la capacidad de predecir la absorción intestinal in vivo. Los perros, en algunos casos, poseen diferentes transportadores de drogas y enzimas metabolizadoras que los humanos50.
Además, el sistema organoide canino debe probarse en una variedad de otros aparatos de doble cámara de otros fabricantes para determinar la idoneidad de dicho modelo (por ejemplo, se debe determinar la idoneidad de diferentes composiciones de membranas filtrantes). Otra desventaja es que la parte del experimento de permeabilidad a la droga del manuscrito es menos descriptiva que las partes anteriores. Esto es causado por un exceso de información en este campo. El objetivo de esta parte del manuscrito era describir estos métodos de una manera modificable sin cortar los bordes de las piedras angulares de estos experimentos. Hubatsch et al.37 han recogido información más detallada sobre los experimentos de permeabilidad. Además, los insertos permeables se pueden utilizar en experimentos de cocultivo, migración celular y ensayo de invasión4.
En conclusión, los organoides intestinales caninos en aparatos de cultivo de doble cámara tienen el potencial de ser utilizados en una amplia gama de aplicaciones, incluidos los campos biomédicos y la medicina traslacional, por nombrar algunos. Los protocolos crean varias estrategias para planificar un experimento y promover la confiabilidad de los datos entre laboratorios para modelos organoides en todo el campo de la biología.

Los sistemas de soporte permeables se utilizan típicamente para determinar la permeabilidad aparente de los candidatos a fármacos terapéuticos a través de la barrera epitelial intestinal 1,2. También se pueden emplear para evaluar la secreción celular3, la migración celular4 y la toxicidad del fármaco5. Los ensayos de permeabilidad oral de fármacos in vitro son un paso clave en el proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos2, con candidatos a fármacos individuales que se prueban en la etapa temprana del ciclo de vida de I+D de fármacos6. El sistema de soporte permeable es un aparato de cultivo celular de doble cámara que consiste en un inserto con una membrana semiporosa colocada en una placa multipocillo. Este sistema permite el acceso directo a los lados apical y basolateral de una célula-monocapa cultivada en el inserto7. La monocapa utilizada en estos sistemas se deriva típicamente de células epiteliales gastrointestinales (por ejemplo, la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano Caco-2)8. Los cultivos celulares crecen en un estado polarizado imitando la microarquitectura natural de las células epiteliales intestinales, lo que permite una mayor diferenciación celular, microanatomía similar y función7. Los detalles del inserto de soporte permeable se pueden encontrar en la Figura 1. La siembra de los insertos con cultivos celulares 2D, tradicionalmente utilizados para evaluar la permeabilidad intestinal a fármacos, es relativamente asequible y fácil de cultivar9. Estos sistemas presentan varias limitaciones importantes, incluyendo su limitada capacidad para predecir el metabolismo intestinal de los candidatos a fármacos terapéuticos10,11. Esto es cierto para todos los mecanismos de absorción de fármacos, ya sea la absorción pasiva a través de las uniones estrechas entre las células epiteliales, la absorción transepitelial activa a través del eflujo o los transportadores de captación (por ejemplo, glicoproteína P, transportador de monocarboxilato 1) y los fármacos que son metabolizados por los enterocitos.
Los perros comparten un ambiente común y una dieta con los humanos12. La anatomía intestinal canina y la composición del microbioma se parecen mucho a la de los humanos13, lo que se ha atribuido a la domesticación y las dietas compartidas en los últimos 36.000 años14. Desafortunadamente, estas similitudes también pueden ser causas / desencadenantes comunes para el desarrollo de la enfermedad. Los perros desarrollan morbilidades crónicas similares a las de los humanos, como obesidad15, enfermedad inflamatoria intestinal16, adenocarcinoma colorrectal17, tumor del estroma gastrointestinal (GIST)18 y varias otras patologías asociadas con su longevidad relativa19. En consecuencia, los organoides caninos pueden utilizarse con éxito para la investigación traslacional inversa de estas enfermedades multifactoriales crónicas en el espíritu de la Iniciativa One Health20.
Las células Caco-2 son las líneas celulares más utilizadas para los ensayos de absorción oral de fármacos21. Estas células se consideran actualmente el modelo "estándar de oro" para los ensayos de permeabilidad intestinal in vitro 2,22,23. La línea celular Caco-2 expresa transportadores de eflujo y captación que se encuentran en el tracto intestinal humano, aunque a diferentes niveles de expresión 24,25,26. Las células Caco-2 también son ampliamente utilizadas como modelos para determinar si un fármaco es un sustrato o inhibidor de los transportadores de eflujo intestinal22,27. Aunque las células Caco-2 son de origen colónico, imitan a una célula de enterocito. Desafortunadamente, las células Caco-2 solo representan un tipo de célula de la capa epitelial del intestino delgado9, que no logra recapitular la compleja composición del tipo de célula epitelial intestinal con precisión. Por ejemplo, las células caliciformes dedicadas a la producción de moco están ausentes de los cultivos con Caco-2, de modo que las interacciones moco-fármaco no pueden evaluarse sin el cocultivo con otras líneas celulares28. Además, los cultivos de Caco-2 no expresan varios de los receptores nucleares importantes típicamente presentes en el intestino, como el receptor pregnano X (PXR), el receptor X esteroide (SXR) y el receptor constitutivo de androstano (CAR)29. En consecuencia, los cultivos de Caco-2 no logran modelar la inducción de transportadores de fármacos y enzimas por ciertos fármacos que son inductores de estos receptores (por ejemplo, rifampicina)30.
La tecnología de organoides intestinales 3D aborda algunas de estas limitaciones19. Los organoides son construcciones autoensambladas derivadas de células madre adultas que se pueden establecer a partir de muestras de tejido cosechadas mediante técnicas microinvasivas20. Las células madre pluripotentes inducidas por el hombre se están empleando para los modelos de permeabilidad intestinal31,32. Los organoides caninos proporcionan una alternativa relevante a los organoides humanos porque la investigación con células madre humanas está restringida por cuestiones éticas33. Además, los organoides caninos proporcionan un sistema in vitro para explorar la permeabilidad de los medicamentos caninos, el metabolismo, el transporte activo y las interacciones medicamentosas. Para abordar esta brecha tecnológica, se ha descrito el crecimiento consistente y confiable de organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable34. Un ensayo de permeabilidad con organoides intestinales caninos puede predecir potencialmente la permeabilidad intestinal canina y el metabolismo de moléculas de fármacos pequeños en comparación con los ensayos utilizados actualmente (Caco-2). La confirmación de estas características fundamentales presta este novedoso sistema in vitro para futuros trabajos que exploren el impacto potencial de los inductores en el metabolismo intracelular y el transporte activo.
Los organoides caninos están compuestos por todos los tipos de células típicamente presentes en la capa epitelial del intestino. Desde un punto de vista funcional y microanatómico, replican de forma fiable el entorno de la capa epitelial del intestino canino19,35. Además, la presencia de moco, transportadores de fármacos y enzimas específicos de los perros, y la diferenciación celular general en los organoides intestinales caninos es comparable a lo que se ve in vivo en los perros34. Por lo tanto, los organoides pueden aislarse de pacientes veterinarios enfermos y utilizarse para modelar el efecto de diversos procesos de enfermedad (por ejemplo, inflamación intestinal crónica) sobre la permeabilidad a los medicamentos orales caninos19,36. El sistema organoide intestinal canino también se puede utilizar en otros entornos que no sean experimentos de permeabilidad a las drogas. Estas estructuras 3D también se pueden aislar de pacientes enfermos como lo describieron previamente Chandra et al. para la enfermedad inflamatoria intestinal, el adenocarcinoma colorrectal y el tumor del estroma gastrointestinal19.
El Protocolo de Siembra de Soporte Permeable describe métodos para establecer cultivos de organoides intestinales caninos en los insertos. Este primer protocolo describe métodos para disociar cultivos organoides caninos establecidos chapados en la matriz de membrana extracelular. Además, el prerecubrimiento de los insertos con colágeno I y la matriz de membrana extracelular se discute en este protocolo. La incrustación de organoides caninos en los insertos de soporte permeables también se describe en detalle.
El segundo protocolo es el Protocolo de Mantenimiento monocapa, que incluye el mantenimiento general de organoides caninos 3D chapados en un inserto. La frecuencia y los volúmenes de los medios organoides utilizados para refrescar el cultivo, y las formas de prevenir el daño del cultivo celular, se presentan en este segundo protocolo, junto con los métodos experimentales para evaluar la confluencia de la monocapa epitelial.
Finalmente, el Protocolo Experimental de Permeabilidad se centra en las formas de determinar si los organoides 3D intestinales caninos en un ensayo de permeabilidad están listos para su uso experimental y los pasos de verificación necesarios antes de realizar cualquier experimento. Esta sección también describe la configuración y la ejecución exitosa de un experimento de permeabilidad, junto con la incubación y el muestreo de candidatos a fármacos terapéuticos en las cámaras del cultivo monocapa. También se discute el uso del isotiocianato de fluoresceína de baja permeabilidad (FITC-dextran) para monitorear la integridad de la monocapa. Finalmente, se describe un método de evaluación in vitro para validar los resultados después de la conclusión de un experimento. Los experimentos de permeabilidad son un tema extremadamente vasto y están muy bien resumidos por Hubatsch et al.37. El flujo de trabajo de los protocolos se resume en la Figura 2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Figura 1: Organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable. El inserto de soporte permeable se coloca en un pozo de una placa de 24 pocillos. La membrana microporosa permite la siembra de organoides intestinales caninos disociados, y estas células eventualmente formarán una monocapa organoide 2D. Esta tecnología permite el acceso a los lados AP y BL de la monocapa. El medio organoide se introduce en las cámaras AP y BL del soporte permeable. Se ilustra la absorción (AP→BL) y la secreción (BL→AP) del fármaco candidato, así como dos posibles modos de transporte de fármacos. Abreviaturas: AP = apical; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo de protocolos de soporte permeable a organoides caninos. El inserto de soporte permeable se recubre previamente con una mezcla de la matriz de membrana extracelular y colágeno I y se incuba durante 1 h. Durante el proceso de incubación, el cultivo de organoides se disocia. Las células organoides individuales se siembran en el inserto, el medio en la cámara basolateral se agrega inmediatamente después de la siembra, mientras que el medio a la cámara apical se agrega 24 h después de que concluye el proceso de siembra. El mantenimiento y el monitoreo de los organoides incluyen cambios regulares en el medio, mediciones del valor TEER y microscopía de luz para evaluar la integridad de la monocapa. Antes del experimento, los organoides deben diferenciarse eliminando el inhibidor de ROCK y GSKiβ de los medios. Los valores de TEER se miden el día del experimento, y la monocapa organoide se inspecciona a través de microscopía de luz para detectar daños en las células. El medio se intercambia por un tampón apropiado y se incuba antes del experimento. El ensayo FITC-dextran se utiliza durante los experimentos de permeabilidad intestinal39 como marcador de integridad monocapa. Las mediciones de TEER se toman después del experimento, y la microscopía de luz validará los resultados después de 24 h. Abreviaturas: TEER = resistencia eléctrica transepitelial; ROCK = quinasa asociada a rho; GSKiβ = glucógeno sintasa quinasa beta; F = fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;ROCK inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>EMD Millipore Corp.</td>
			<td>SCM 075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15]-Gastrin I human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>9094360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human R-Spondin-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>120-38-500UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38-250UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190 (P38 inhibitor)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&#946;)</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS (trimethoprim sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7883-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, Glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha-D(+)-Glucose, 99+%, anhydrous</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>170080010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CM-Dextran</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>68059-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde (37%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>F79P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix For Organoid Culture</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td>Extracellular Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1x (Phosphate-Buffered Saline)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td>Trypsin-like Protease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell 6.5 mm Polyester Membrane Inserts Preloaded in 24-Well Culture Plates, Pore Size: 0.4 &#181;m, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3470</td>
			<td>Permeable Support</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS (Probes)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERSSTX01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MERS00002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panasonic incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170ML-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Wrapping Film</td>
			<td>Bemis Company Inc</td>
			<td>PM996/EMD</td>
			<td>Flexible Laboratory Film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Plate 24 wells</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012929</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system

El sistema de soporte permeable se utiliza típicamente junto con líneas celulares bidimensionales tradicionales (2D) como una herramienta in vitro para evaluar la permeabilidad oral de nuevos candidatos a fármacos terapéuticos. Sin embargo, el uso de estas líneas celulares convencionales tiene limitaciones, como la expresión alterada de uniones estrechas, la diferenciación celular parcial y la ausencia de receptores nucleares clave. A pesar de estas deficiencias, los modelos Caco-2 y MDCK son ampliamente aceptados y validados para la predicción de la permeabilidad oral humana in vivo .
Los perros son un modelo traslacional relevante para la investigación biomédica debido a sus similitudes en la anatomía gastrointestinal y la microflora intestinal con los humanos. En consecuencia, y en apoyo del desarrollo paralelo de fármacos, es muy deseable la elaboración de una herramienta in vitro eficiente y precisa para predecir las características de permeabilidad de los fármacos in vivo tanto en perros como en humanos. Tal herramienta podría ser el sistema organoide intestinal canino, caracterizado por estructuras epiteliales tridimensionales (3D) autoensambladas derivadas de células madre adultas.
El (1) Protocolo de Siembra de Apoyo Permeable describe los métodos experimentales para disociar y sembrar organoides caninos en los insertos. El aislamiento, el cultivo y la cosecha de organoides caninos se han descrito previamente en un conjunto separado de protocolos en este número especial. Los métodos para el mantenimiento general de la monocapa organoide intestinal canina se discuten a fondo en el (2) Protocolo de mantenimiento de monocapa. Además, este protocolo describe métodos para evaluar la integridad estructural de la monocapa a través de mediciones de resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y microscopía de luz. Finalmente, el (3) Protocolo Experimental de Permeabilidad describe las tareas que preceden directamente a un experimento, incluida la validación in vitro de los resultados experimentales.
En general, el modelo organoide canino, combinado con una tecnología de cultivo celular de doble cámara, supera las limitaciones asociadas con los modelos experimentales 2D, mejorando así la fiabilidad de las predicciones de la aparente permeabilidad oral de los candidatos a fármacos terapéuticos tanto en el paciente canino como en el humano.

Los procedimientos operativos estándar para el cultivo de organoides caninos se describieron anteriormente33, y el Protocolo de Organoides Caninos también se ha discutido en detalle en este número especial38. Los organoides intestinales caninos cultivados en soportes permeables fueron fijos e incrustados en parafina para examinar la microanatomía de la monocapa y las poblaciones celulares. El proceso de incrustación de parafina fue discutido previamente por Gabriel et al.38. Se ha realizado una tinción de rutina (hematoxilina y eosina), y se utilizó la técnica de tinción azul alciano para detectar células caliciformes en la monocapa organoide canina (ver Figura 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Figura 7: Tinción monocapa organoide intestinal canina. Los organoides intestinales caninos de origen colónico en el soporte permeable han sido incrustados en parafina y teñidos con H&E y AB. Se tomaron imágenes representativas utilizando microscopía de luz a un aumento de 40x (A) y 60x (B). La tinción de H&E revela una monocapa epitelial columnar, y las microvellosidades en la parte apical de las células se pueden observar a un aumento de 60x. La tinción AB revela aún más la presencia de células caliciformes (azul oscuro) en la monocapa organoide intestinal canina. Barras de escala = 20 μm (A), 50 μm (B). Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina; AB = Azul alciano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El cultivo de organoides en el soporte permeable debe cultivarse durante 10 a 14 días para estar listo para un experimento de permeabilidad. La microscopía de luz se utiliza junto con las mediciones del valor de TEER para confirmar la preparación del cultivo de organoides para las pruebas de permeabilidad de los candidatos a fármacos. En la Figura 8 se presentan imágenes microscópicas de luz representativas de diferentes monocapas organoides intestinales caninas de animales sanos y enfermos.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Figura 8: Microscopía monocapa organoide intestinal canina. Imágenes de monocapas en crecimiento vistas bajo microscopía de luz. Las monocapas organoides derivadas de donantes sanos están representadas por cultivos enteroides yeyunales (10x; 40x) y colonoides (20x; 40x). Las monocapas organoides de donantes enfermos están representadas por enteroides duodenales (5x; 10x) e ileales (5x; 10x) derivados de un paciente canino diagnosticado con PLE. Ambos cultivos organoides PLE son ejemplos de aislamiento celular inadecuado durante la siembra de organoides, y estos cultivos no pudieron usarse para ensayos de permeabilidad a fármacos debido a la presencia de organoides 3D. Los ejemplos de desviaciones de la formación adecuada de monocapa, como los desgarros monocapa (5x), son causados por la manipulación descuidada de las muestras biológicas. El cultivo prolongado de organoides (10x; 20x) es causado por el mantenimiento prolongado de los organoides en el inserto cuando los organoides comienzan a parecerse a su estructura 3D original. A modo de comparación, se presentan imágenes de líneas celulares 2D tradicionales en los soportes permeables utilizados comúnmente para estudios de permeabilidad de fármacos (MDCK-10x; 40x, y Caco-2-10x; 20x). Abreviaturas: PLE = enteropatía perdedora de proteínas; MDCK = Riñón canino de Madin-Darby. Barras de escala = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Las monocapas organoides también se fijaron en glutaraldehído al 3% paraformaldehído-3% en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para caracterizar la ultraestructura del cultivo de organoides en los soportes permeables. Las estructuras microanatómicas de microvellosidades y uniones estrechas se pueden ver en la Figura 9.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Figura 9: Imágenes TEM de monocapas organoides intestinales caninas sanas. Tem se utilizó para revelar la microarquitectura celular de las monocapas organoides yeyunales (A), ileales (B) y colónicas (C). La membrana microporosa del inserto de soporte permeable está marcada con una flecha amarilla. La presencia de microvellosidades (flecha azul) y uniones estrechas (flecha roja) se delinea en las imágenes. Abreviatura: TEM = Microscopía electrónica de transmisión. Barras de escala = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tanto las mediciones TEER como la microscopía de luz deben realizarse para garantizar que el sistema esté listo para las pruebas de permeabilidad. El ensayo está listo para su uso cuando TEER alcanza un estado estacionario, mientras que la microscopía de luz ayudará a excluir el daño o el crecimiento excesivo de los organoides. En la Figura 6 se presenta un resumen de las mediciones típicas de TEER de cinco grupos que consisten en enteroides y colonoides yeyunales caninos.
Tabla 1: Composición de medios organoides y FAA. La composición completa de CMGF+, CMGF+ R/G y FAA se resume en esta tabla. Abreviaturas: ROCK = quinasa asociada a rho; GSKiβ = glucógeno sintasa quinasa beta; CMGF + R/G = Medio completo con factores de crecimiento potenciados con inhibidor de ROCK y GSKiβ; CMGF+ = Medio completo con factores de crecimiento pero sin inhibidor de ROCK o GSKiβ; FAA = formalina-ácido acético-alcohol; EGF = factor de crecimiento epidérmico. Esta tabla está adaptada de 38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 1: Tabla para la toma de notas sobre el organoide canino el sistema de soporte permeable. Abreviaturas: TEER = resistencia eléctrica transepitelial; ROCK = quinasa asociada a rho; GSKiβ = glucógeno sintasa quinasa beta; CMGF + R/G = Medio completo con factores de crecimiento potenciados con inhibidor de ROCK y GSKiβ; CMGF+ = Medio completo con factores de crecimiento pero sin inhibidor de ROCK o GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Aquí, presentamos un protocolo que describe el cultivo de organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable de doble cámara. Se describe la siembra de organoides en los soportes permeables, el mantenimiento de la monocapa y los experimentos posteriores de permeabilidad al fármaco.

Organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable de doble cámara

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K vistas.  Iowa State University. Aquí, presentamos un protocolo que describe el cultivo de organoides intestinales caninos en un sistema de soporte permeable de doble cámara. Se describe la siembra de organoides en los soportes permeables, el mantenimiento de la monocapa y los experimentos posteriores de permeabilidad al fármaco.

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Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the up- and down-regulation of gene expression rely on the transfection of stably maintained plasmids. While these have increased our understanding of Entamoeba virulence factors, the capacity to integrate exogenous DNA into genome, which would allow reverse genetics experiments, would be a significant advantage in the study of this parasite. The challenges presented by this organism include inability to select for homologous recombination events and difficulty to cure episomal plasmid DNA from transfected trophozoites. The later results in a high background of exogenous DNA, a major problem in the identification of trophozoites in which a bona fide genomic integration event has occurred. We report the development of a negative selection system based upon transgenic expression of a yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyl transferase chimera (FCU1) and selection with prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). The FCU1 enzyme converts non-toxic 5-FC into toxic 5-fluorouracil and 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. histolytica lines expressing FCU1 were found to be 30 fold more sensitive to the prodrug compared to the control strain.

Development of a Negative Selectable Marker for Entamoeba histolytica

We report development of a negative selection system in E. histolytica based upon transgenic expression of a chimeric protein (FCU1) and selection with the prodrug 5-fluorocytosine. The FCU1 protein is a fusion of yeast cytosine deaminase and uracil phosphoribosyltransferase. Expression of FCU1 resulted in increased E. histolytica sensitivity towards 5-fluorocytosine.

Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica</em

Entamoeba histolytica is the causative agent of amebiasis and infects up to 10% of the world's population. The molecular techniques that have enabled the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

Implementación de un Sistema de infección basada en la inserción de membrana permeable para estudiar los efectos de toxinas secretadas bacterianas en células huésped de mamífero

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and maintained in culture, provides an exciting opportunity to facilitate the modeling of the epithelial response to enteric infections. In vivo, intestinal epithelial cells (IECs) play a key role in regulating intestinal homeostasis and may directly inhibit pathogens, although the mechanisms by which this occurs are not fully elucidated. The cytokine interleukin-22 (IL-22) has been shown to play a role in the maintenance and defense of the gut epithelial barrier, including inducing a release of antimicrobial peptides and chemokines in response to infection.
We describe the differentiation of healthy control hiPSCs into iHOs via the addition of specific cytokine combinations to their culture medium before embedding them into a basement membrane matrix-based prointestinal culture system. Once embedded, the iHOs are grown in media supplemented with Noggin, R-spondin-1, epidermal growth factor (EGF), CHIR99021, prostaglandin E2, and Y-27632 dihydrochloride monohydrate. Weekly passages by manual disruption of the iHO ultrastructure lead to the formation of budded iHOs, with some exhibiting a crypt/villus structure. All iHOs demonstrate a differentiated epithelium consisting of goblet cells, enteroendocrine cells, Paneth cells, and polarized enterocytes, which can be confirmed via immunostaining for specific markers of each cell subset, transmission electron microscopy (TEM), and quantitative PCR (qPCR). To model infection, Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 are microinjected into the lumen of the iHOs and incubated for 90 min at 37 &#176;C, and a modified gentamicin protection assay is performed to identify the levels of intracellular bacterial invasion. Some iHOs are also pretreated with recombinant human IL-22 (rhIL-22) prior to infection to establish whether this cytokine is protective against Salmonella infection.

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Intestinal Organoids to Study and Modify Epithelial Cell Protection Against Salmonella and Other Pathogens

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived intestinal organoids offer exciting opportunities to model enteric diseases in vitro. We demonstrate the differentiation of hiPSCs into intestinal organoids (iHOs), the stimulation of these iHOs with cytokines, and the microinjection of Salmonella Typhimurium into the iHO lumen, enabling the study of an epithelial invasion by this pathogen.

Usando organoides intestinales derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos para estudiar y modificar la protección de células epiteliales contra Salmonella y otros patógenos

The intestinal &#8216;organoid&#8217; (iHO) system, wherein 3-D structures representative of the epithelial lining of the human gut can be produced from ...