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May 19th, 2023
DOI :
May 19th, 2023
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Introduction
1:33
Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) to Purify CD31+ Endothelial Progenitor Cells (EPCs)
5:27
Selective Passage to Purify EECM‐BMEC‐Like Cells and SMLCs
7:07
Results: Immunofluorescence Staining, Flow Cytometry Analysis, and Immune Cell Adhesion
8:29
Conclusion
Transcript
यह पहला प्रोटोकॉल है जो मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में अच्छे बाधा गुणों, परिपक्व तंग जंक्शनों और एंडोथेलियल सेल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति के साथ अंतर करने की अनुमति देता है जो केंद्रीय नौसिखिया प्रणाली में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास की मध्यस्थता करते हैं। ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाएं पूरी तरह से ऑटोलॉगस फैशन में रोगियों से प्राप्त रक्त मस्तिष्क बाधा मॉडल के साथ रक्त मस्तिष्क बाधा में प्रतिरक्षा कोशिका प्रवास का अध्ययन करने की अनुमति देती हैं। एमएस रोगियों से मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं में अलग करने से हमें एमएस रोगियों के इन इन विट्रो मॉडल में आंतरिक बाधा दोषों की पहचान करने की अनुमति मिली है।
इसलिए यह सांस्कृतिक विधि हमें भविष्य में इन बिगड़ा हुआ बाधा गुणों को अंतर्निहित आणविक मार्गों की पहचान करने की अनुमति देगी। इन विधियों को बीमारियों के व्यापक स्पेक्ट्रम पर लागू किया जा सकता है जहां सीरम आकृति विज्ञान और सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ इन रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं, उदाहरण के लिए, स्ट्रोक या न्यूरोसंक्रमण। पहली बार इस तकनीक की कोशिश करते समय, सेल सामग्री की समान मात्रा का उपयोग करें।
सीडिंग घनत्व इस प्रोटोकॉल की सफलता की कुंजी है और उपयोग किए गए क्लोन के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से सहायक प्रोफेसर किन्या मात्सुओ होगा। एंडोथेलियल पूर्वज कोशिका संवर्धन के पांचवें दिन कुएं से माध्यम को अलग किया जाता है और प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ा जाता है।
37 डिग्री सेल्सियस पर छह से आठ मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करने से कोशिकाओं को अलग और एकवचन किया जाता है। फिर, सेल निलंबन को 40 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर ट्यूब में फ़िल्टर करने के लिए पास करें जिसमें 10 मिलीलीटर डीएमईएम / एफ -12 10 माध्यम होता है।
पाचन प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, 50 मिलीलीटर के निशान तक डीएम डीएमईएम / एफ -12 10 मध्यम जोड़ें। कोशिकाओं की गिनती के लिए अच्छी तरह से पिपेट और 10 माइक्रोलीटर आरक्षित करें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर 50 मिलीलीटर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और डीएमईएम / एफ -12 10 माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन को एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को फिर से पेलेट करने के लिए 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
फिर सेल गोली को प्रवाह बफर में पुन: निलंबित करें। इसके बाद, एफसीआर ब्लॉकिंग अभिकर्मक को एक से 100 अनुपात में जोड़ें और पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर एक से 200 अनुपात पतला फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट या एफआईटीसी लेबल सीडी 31 एंटीबॉडी जोड़ें।
20 से 25 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सस्पेंशन को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, नमूने में 10 मिलीलीटर प्रवाह बफर एक जोड़ें और सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं के अंश को निर्धारित करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए निलंबन के 10 माइक्रोलीटर आरक्षित करें। 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्रवाह बफर एक समाधान के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इसके बाद, सेल निलंबन के प्रति 100 माइक्रोलीटर एफआईटीसी चयन कॉकटेल के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। पाइपटिंग द्वारा घोल को अच्छी तरह से मिलाएं और 20 से 25 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान पर 15 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, सेल निलंबन के प्रति 100 माइक्रोलीटर में चुंबकीय नैनोकणों के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें। मिश्रण को अच्छी तरह से पिपेट करें और 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। सेल निलंबन को पांच मिलीलीटर फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए फ्लो बफर जोड़ें।
फिर फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब को चुंबक में पांच मिनट के लिए रखें। एक निरंतर गति में, चुंबक को उल्टा करें और एफआईटीसी सीडी 31 एंटीबॉडी अनलेबल कोशिकाओं वाले सेल निलंबन को हटा दें। चुंबक और ट्यूब को दो से तीन सेकंड के लिए उल्टे स्थिति में बनाए रखें और फिर शेष तरल को हटा दें।
ट्यूब को सीधी स्थिति में वापस करने से पहले ट्यूब के किनारे पर किसी भी बूंद को एस्पिरेट करें। चुंबक से फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब को पुनः प्राप्त करें और शेष सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं को धोने के लिए 2.5 मिलीलीटर प्रवाह बफर जोड़ें। कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे दो या तीन बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
फिर प्रवाह ट्यूब को चुंबक में पांच मिनट के लिए रखें। ट्यूब से एफआईटीसी सीडी 31 अनलेबल कोशिकाओं को हटाने के लिए धोने को कम से कम चार बार दोहराएं। चुंबक से प्रवाह ट्यूब को हटा दें और एक उपयुक्त माध्यम की वांछित मात्रा के साथ शुद्ध सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
निलंबन के दो 10 माइक्रोलीटर एलिकोट आरक्षित करें, एक सेल गिनती के लिए और दूसरा पोस्ट-चुंबकीय सक्रिय सेल सॉर्टिंग नमूनों में सीडी 31 सकारात्मक कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करने के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण करने के लिए। एंडोथेलियल और गैर-एंडोथेलियल सेल आबादी वाले छह कुएं प्लेटों से एचईसीएसआर माध्यम को हटा दें। फिर प्रत्येक कुएं में एक मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक जोड़ें।
माइक्रोस्कोप के तहत कोशिका आकृति विज्ञान का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें। जब एंडोथेलियल कोशिकाएं उज्ज्वल और गोल दिखाई देती हैं, आमतौर पर दो से पांच मिनट के भीतर, प्लेट के किनारे को टैप करके उन्हें अलग करें। गैर-एंडोथेलियल कोशिकाएं प्लेट से जुड़ी रहती हैं।
एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, गैर-एंडोथेलियल कोशिकाओं को परेशान किए बिना अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें और उन्हें 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें डीएमईएम / एफ -12 10 प्रति मिलीलीटर पृथक्करण अभिकर्मक के चार मिलीलीटर होते हैं। फिर कोशिकाओं या एसएमएलसी जैसी चिकनी मांसपेशियों को स्थापित करने के लिए शेष संलग्न गैर-एंडोथेलियल कोशिकाओं वाले कुओं में दो मिलीलीटर एचईसीएसआर माध्यम जोड़ें और प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें। एंडोथेलियल सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
अच्छी तरह से मिलाएं और सेल गिनती के लिए निलंबन के 10 माइक्रोलीटर आरक्षित करें। शेष कोशिकाओं को 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। फिर दो मिलीलीटर एचईसीएसआर माध्यम जोड़ें।
इसके बाद, पहले से तैयार कोलेजन कोडित छह वेल प्लेट से समाधान के लिए कोलेजन को हटा दें और प्रत्येक कुएं में एंडोथेलियल सेल निलंबन के दो मिलीलीटर जोड़ें। फिर, प्लेट को 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेल आकृति विज्ञान और निरंतर और परिपक्व जंक्शनों की उपस्थिति का आकलन करने के लिए क्लॉडिन -5, ऑक्लुडिन और वीई-कैडरिन सहित ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल जंक्शनल अणुओं के इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन का उपयोग किया गया था।
ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की उत्तेजना जो प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स जैसे ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा और इंटरफेरॉन गामा के साथ एसएमएलसी व्युत्पन्न वातानुकूलित माध्यम में पतला होती है, ने आईसीएएम -1 और वीसीएएम -1 जैसे आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को विनियमित किया। अल्फा चिकनी मांसपेशी एक्टिन, कैलपोनिन और चिकनी मांसपेशी प्रोटीन 22 अल्फा सहित चिकनी मांसपेशी कोशिका मार्करों की प्रतिनिधि छवियां यहां दिखाई गई हैं। ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा और इंटरफेरॉन गामा जैसे प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं की उत्तेजना ने आईसीएएम -1, वीसीएएम -1 और पी-सेलेक्टिन सहित कई आसंजन अणुओं की कोशिका सतह अभिव्यक्ति को विनियमित किया।
इसके अलावा, भड़काऊ साइटोकिन्स के साथ उत्तेजना ने एंडोथेलियल आसंजन अणुओं की अभिव्यक्ति को भी विनियमित किया और ईईसीएम-बीएमईसी जैसे सेल मोनोलेयर ईईसीएम-बीएमईसी जैसी कोशिकाओं का पालन करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बढ़ती संख्या को बढ़ावा दिया, जो रक्त-मस्तिष्क बाधा स्तर पर पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र की गहन समझ के लिए भी आशाजनक हैं, और रक्त-मस्तिष्क बाधा स्थिरीकरण के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य विकसित करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में।
यहां, हम एक प्रोटोकॉल, विस्तारित एंडोथेलियल सेल कल्चर विधि (ईईसीएम) का वर्णन करते हैं, जो प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को मस्तिष्क माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल सेल (बीएमईसी) जैसी कोशिकाओं में भेदभाव करने की अनुमति देता है। ये कोशिकाएं एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु अभिव्यक्ति दिखाती हैं और इस प्रकार एक मानव रक्त-मस्तिष्क बाधा मॉडल हैं जो विट्रो में प्रतिरक्षा कोशिका इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हैं।
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