これは、ヒト誘導多能性幹細胞を、良好なバリア特性、成熟タイトジャンクション、および中枢初心者系への免疫細胞移動を媒介する内皮細胞接着分子の発現を有する脳微小血管内皮細胞に分化させることを可能にする最初のプロトコルである。EECM-BMEC様細胞は、患者に由来する血液脳関門モデルを用いて、血液脳関門を横切る免疫細胞の移動を完全に自家的に研究することを可能にする。MS患者のヒト誘導多能性幹細胞をEECM-BMEC様細胞に分化させることで、MS患者のこれらのin vitroモデルにおける固有のバリア欠陥を特定することができました。
したがって、この文化的方法は、将来、これらの障害されたバリア特性の根底にある分子経路を特定することを可能にします。これらの方法は、血清形態およびCNSへの免疫細胞浸潤がこれらの病因、例えば脳卒中または神経感染にとって重要であるより広範な疾患に適用することができる。この手法を初めて試すときは、同じ量のセル材料を使用してください。
シード密度はこのプロトコルの成功の鍵であり、使用するクローンに応じて調整する必要があります。手順のデモンストレーションは、私の研究室の助教である松尾欣也さんです。内皮前駆細胞培養の5日目に、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの解離試薬を加える。
プレートを摂氏37度で6〜8分間インキュベートします。マイクロピペットを使用して、細胞を解離および単離化します。次に、細胞懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーに通して、10ミリリットルのDMEM / F-12 10培地を含む50ミリリットルのチューブにろ過します。
消化反応を止めるには、DM DMEM / F-12 10培地を50ミリリットルマークまで加えます。細胞を数えるために10マイクロリットルを徹底的にピペットで入れて予約する。50ミリリットルのチューブを200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEM/F-12 10培地で再懸濁します。細胞懸濁液を新しい15ミリリットルのチューブに移します。200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離し、細胞を再びペレット化します。
次いで、細胞ペレットをフローバッファー1に再懸濁する。次に、FCRブロッキング試薬を1対100の比率で添加し、5分間インキュベートします。次いで、1対200の比率で希釈したフルオレセインイソチオシアネートまたはFITC標識CD31抗体を添加する。
懸濁液を暗所で摂氏20〜25度の温度で30分間インキュベートする。インキュベーションの最後に、10ミリリットルのフローバッファー1をサンプルに加え、フローサイトメトリー分析用に10マイクロリットルの懸濁液を予約して、CD31陽性細胞の画分を測定します。細胞を200gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離します。
遠心分離後、1つの溶液をフローバッファーで細胞を再懸濁する。次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルのFITC選択カクテルを追加します。ピペッティングによって溶液を完全に混合し、摂氏20〜25度の温度で15分間暗所でインキュベートします。
次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルの磁性ナノ粒子を追加します。混合物をよくピペットで入れ、摂氏20〜25度で10分間暗所でインキュベートします。細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移し、フローバッファー1を加えて総容量2.5ミリリットルにします。
次に、フローサイトメトリーチューブを磁石に5分間入れます。連続運動で、磁石を反転させ、FITC CD31抗体非標識細胞を含む細胞懸濁液をデカントします。磁石とチューブを2〜3秒間逆さに保ち、残りの液体を取り除きます。
チューブを直立位置に戻す前に、チューブの端にある液滴を吸引します。磁石からフローサイトメトリーチューブを取り出し、2.5ミリリットルのフローバッファー1を加えて、残りのCD31陽性細胞を洗浄します。細胞を2〜3回ゆっくりと上下にピペットで固定し、再懸濁します。
次に、フローチューブを磁石に5分間入れます。洗浄を少なくとも4回繰り返して、チューブからFITCのCD31非標識細胞を除去した。フローチューブを磁石から取り外し、精製したCD31陽性細胞を所望の量の適切な培地で再懸濁します。
懸濁液の2つの10マイクロリットルアリコートを予約し、1つは細胞計数用、もう1つはフローサイトメトリー分析を実行して、磁気後活性化細胞選別サンプル中のCD31陽性細胞の純度を評価します。内皮細胞集団および非内皮細胞集団を含む6つのウェルプレートからHECSR培地を除去します。次に、各ウェルに1ミリリットルの解離試薬を加えます。
顕微鏡下で細胞の形態を注意深く観察します。内皮細胞が明るく丸く見えたら、通常2〜5分以内に、プレートの端をタップして内皮細胞を切り離します。非内皮細胞はプレートに付着したままである。
マイクロピペットを使用して、剥離した内皮細胞を非内皮細胞を乱すことなく慎重に収集し、解離試薬1ミリリットルあたり4ミリリットルのDMEM/F-12 10を含む15ミリリットルまたは50ミリリットルの遠沈管に移します。次に、残りの付着した非内皮細胞を含むウェルに2ミリリットルのHECSR培地を加えて、平滑筋のような細胞またはSMLCを確立し、プレートをインキュベーターに入れます。内皮細胞懸濁液を遠沈管に移します。
十分に混合し、細胞計数のために10マイクロリットルの懸濁液を予約します。残りの細胞を200 gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離します。次に、2ミリリットルのHECSR培地を追加します。
次に、予め調製したコラーゲンコード化6ウェルプレートからコラーゲン用溶液を取り出し、各ウェルに2ミリリットルの内皮細胞懸濁液を加える。次に、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素中でインキュベートします。クローディン-5、オクルージンおよびVE-カドヘリンを含むEECM-BMEC様細胞接合分子の免疫蛍光染色を使用して、細胞形態および連続および成熟接合の存在を評価しました。
SMLC由来の馴化培地で希釈した腫瘍壊死因子αやインターフェロンガンマなどの炎症誘発性サイトカインを用いてチャンバースライド上に播種したEECM-BMEC様細胞を刺激すると、ICAM-1やVCAM-1などの接着分子の発現がアップレギュレートされました。アルファ平滑筋アクチン、カルポニン、平滑筋タンパク質22αを含む平滑筋細胞マーカーの代表的な画像をここに示す。腫瘍壊死因子αやインターフェロンガンマなどの炎症誘発性サイトカインによるEECM-BMEC様細胞の刺激は、ICAM-1、VCAM-1、およびP-セレクチンを含むいくつかの接着分子の細胞表面発現をアップレギュレートしました。
また、炎症性サイトカインによる刺激は、内皮接着分子の発現をアップレギュレートし、EECM-BMEC様細胞単層に接着する免疫細胞数の増加を促進しました。 EECM-BMEC様細胞は、血液脳関門レベルでの病態生理学的メカニズムの深い理解や、血液脳関門安定化のための新しい治療標的を開発するための貴重なツールとしても有望です。
