Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Action Medical Research (UK) (GN2291) para R.J.M.F. e I.K. O trabalho de pesquisa também foi parcialmente apoiado (custos de animais e apoio à D.D.) pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (H.F.R.I.) no âmbito da "Primeira Chamada para Projetos de Pesquisa H.F.R.I. para apoiar membros do corpo docente e pesquisadores e a aquisição de bolsa de equipamentos de pesquisa de alto custo" (Número do Projeto: 3395).

Os procedimentos de criação, manutenção e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com o UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986, autorizado pelo Ministério do Interior, e com o Decreto Presidencial 56/2013 da República Helênica, examinados pelos Órgãos de Bem-Estar Animal e Revisão Ética das Universidades de Cambridge e Patras, bem como aprovados e examinados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Prefeitura local (número do protocolo: 5675/39/18-01-2021). Foram utilizados ratos machos e fêmeas da linhagem Sprague-Dawley, Wistar e Long-Evans, com idade variando entre 2 e 4 meses e peso corporal entre 150 g e 250 g. O protocolo está resumido graficamente na Figura 1.
1. Liberar o coquetel de preparação
OBS: Prepare fresco no dia do procedimento e mantenha no gelo. As quantidades são dadas por 2 μL a serem injetados i.c.v. em cada ventrículo lateral. Prepare mais 1 μL por injeção pretendida.
<ol><li>Preparar 0,5 μL de neuraminidase 500 mU de Clostridium perfringens (Clostridium welchii). NOTA: Conservar esta conserva em 1 U/μL diluída em água estéril a -20 °C. Outros tipos de neuraminidases não foram testados.</li>
	<li>Preparar 1 μL contendo 1 μg de anticorpo bloqueador de integrina-β1. NOTA: Conservar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 0,5 μL contendo 0,5 μg de fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF-básico humano recombinante). NOTA: Conservar como uma reserva de 1 μg/μL diluída em água estéril a -20 °C.</li>
</ol>2. Injeção de coquetel de liberação
NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 20 min. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.
<ol><li>Anestesiar o animal experimental por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando o reflexo corneano, a reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração. NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). A anestesia profunda foi confirmada pela verificação do reflexo corneano, da reação aos estímulos (teste de pinça dos membros posteriores e cauda) e do modo respiratório.</li>
	<li>Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.</li>
	<li>Monte o rato na estrutura estereotáxica.</li>
	<li>Raspe o pelo da cabeça com uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez. Aplique pomada ocular para evitar o ressecamento.</li>
	<li>Faça uma incisão de 2 cm na pele da cabeça ao longo da linha média usando um bisturi estéril.</li>
	<li>Limpe meticulosamente o crânio usando cotonetes estéreis e soro fisiológico estéril.</li>
	<li>Identifique o bregma utilizando a borda da agulha de uma seringa Hamilton de 10 μL montada no dispositivo estereotáxico. Defina o bregma como "ponto 0,0". OBS: O bregma é identificado como o ponto de intersecção entre as suturas sagital e coronal. Mais detalhes podem ser encontrados no atlas do cérebro de ratos de Paxinos e Watson5.</li>
	<li>Deslocar o aparelho para as coordenadas anteroposterior (AP) = 0,3 mm, lateral (L) = +1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (para atingir a CC).</li>
	<li>Faça um furo de rebarba de 1 mm usando uma broca dental. NOTA: Ao perfurar manualmente, tome cuidado para não ferir a superfície cortical. Não se espera que a hemorragia seja considerável. Limpe qualquer sangue com soro fisiológico e aplique pressão para parar o sangramento mais persistente.</li>
	<li>Coloque 4 μL do cocktail de libertação na seringa Hamilton de 10 μL.</li>
	<li>Abaixe a agulha (de preferência romba ou borda cônica) da seringa de Hamilton para entrar em contato com a dura-máter.</li>
	<li>Inserir a agulha na profundidade desejada (D = 3,5 mm). NOTA: Despeje soro fisiológico na superfície da dura-máter para manter o tecido hidratado.</li>
	<li>Infundir 2 μL do cocktail de libertação a uma taxa de 1 μL/min.</li>
	<li>Deixe a agulha no lugar por mais 2 minutos antes da recuperação lenta para evitar o surgimento do coquetel de liberação.</li>
	<li>Repita os passos 2,8-2,14 para o outro hemisfério nas coordenadas AP = 0,3 mm, L = -1,2 mm (para atingir a ZEE) ou AP = 1,5 mm, L = -2,0 mm (para atingir a CC).</li>
	<li>Sutura da incisão com náilon 5-0 (diâmetro 0,1 mm) e limpeza da área suturada com antisséptico.</li>
	<li>Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitorização pós-operatória. NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.<ol><li>Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após confirmar a recuperação completa.</li>
		<li>Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Resolva os sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio) administrando analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina, por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Biópsia líquida do líquido cefalorraquidiano (LCR)
NOTA: Todo o processo pode ser realizado dentro de 10 min. A biópsia líquida descrita aqui é realizada 3 dias após a injeção do coquetel de liberação, mas pode ser realizada exatamente da mesma maneira sempre que necessário. Tome o cuidado de realizar a cirurgia em condições assépticas. Limpe todas as superfícies com antisséptico (por exemplo, peróxido de hidrogênio a 3% ou 6%). Use ferramentas, luvas, aventais e campos autoclavados ou prontamente estéreis.
<ol><li>Anestesiar o animal por inalação de isoflurano (2,5% para indução e 2% para manutenção). Confirme a profundidade da anestesia verificando a córnea reflexo, a reação aos estímulos (teste da pinça dos membros posteriores e cauda) e o modo de respiração. NOTA: Os procedimentos cirúrgicos podem ser realizados sob anestesia geral induzida por anestesia intraperitoneal injetável (por exemplo, cetamina [40 mg/kg] e xilazina [10 mg/kg]). No entanto, isso não é aconselhável, pois o procedimento é curto, especialmente se as biópsias forem realizadas várias vezes em dias consecutivos.</li>
	<li>Administrar analgesia por via subcutânea (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina) na indução anestésica.</li>
	<li>Monte o animal experimental sobre a estrutura estereotáxica. Use barras auriculares para fixar a cabeça sem obstruir o movimento rotacional em direção à frente e às costas.</li>
	<li>Estabilize a cabeça em um ângulo descendente de 40° para que uma boa extensão da parte de trás do pescoço possa ser alcançada. Observação : uma maneira de fazer isso é usando a barra de boca do dispositivo6.</li>
	<li>Raspe o pelo na área do pescoço usando uma navalha e limpe a pele com antisséptico, como solução de iodopovidona a 10% e, em seguida, álcool. Aplique o antisséptico três vezes usando cotonetes estéreis. Esfregue em um movimento circular por 3-5 s de cada vez.</li>
	<li>Com a ponta do dedo, encontrar a área depressível em forma de losango posicionada entre a protuberância occipital e a espinha do atlas6.</li>
	<li>Desenhe um ponto (por exemplo, usando um marcador).</li>
	<li>Fixe uma seringa de 1 ml ou 0,5 ml na estrutura estereotáxica. OBS: É aconselhável o uso de seringas com agulhas não destacáveis, pois produzem melhor sucção e possuem menor volume morto.</li>
	<li>Traga a agulha no ponto de contacto com a pele na marca pontual.</li>
	<li>Com um par de pinças, levante a pele enquanto abaixa a seringa através das camadas da pele.</li>
	<li>Recupere ligeiramente o êmbolo para gerar pressão negativa na seringa.</li>
	<li>Reinicie para mergulhar a agulha muito lentamente até que o líquido (LCR) apareça na seringa.</li>
	<li>Assente a agulha nesta posição e permita o fluxo lento do líquor. NOTA: A agulha pode ser abaixada ou elevada ligeiramente se o fluxo do LCR for muito lento.</li>
	<li>Iniciar a remoção lenta do líquor (em passos de 40 μL/min) até 120 μL.</li>
	<li>Recupere lentamente a seringa.</li>
	<li>Administrar intraperitonealmente 1 mL de soro normal para apoiar a reposição de fluidos do animal experimental.</li>
	<li>Misturar a biópsia líquida (LCR) com 400 μL de meio NSC e manter o tubo de microcentrífuga a 4 °C até nova utilização. NOTA: As biópsias líquidas devem ser processadas dentro de 3 h se não forem congeladas.</li>
	<li>Retirar a máscara que fornece o anestésico e transferir o animal para a área de monitoramento pós-operatório. NOTA: A recuperação da anestesia e a manutenção da decúbito devem ocorrer dentro de 5-10 min, e a recuperação completa (comportamento normal) dentro de 25 min.<ol><li>Monitore de perto a recuperação (movimento vívido e ininterrupto, acesso frequente à água) em um espaço bem aquecido (24-25 °C), silencioso, sem camas de partículas pequenas, que podem bloquear as vias aéreas. Devolva o animal à companhia de seus companheiros de gaiola (não a novos animais) somente após a recuperação total ter sido confirmada.</li>
		<li>Monitorar o animal na instalação de manutenção por pelo menos 48 h após a cirurgia. Se forem observados sinais de dor (ocultação da cabeça, postura anormal da cabeça ou do corpo, hipersensibilidade e hiperexcitabilidade ao manuseio), administrar analgesia (por exemplo, 0,3 mg/mL de buprenorfina por via subcutânea). Encaminhe animais com pelos descoloridos ou erguidos ao veterinário responsável.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Processamento de tecidos para imunofluorescência
<ol><li>Eutanásia do animal por infusão intracárdica de 20 mL de solução salina gelada, seguida de 50 mL de paraformaldeído a 4% gelado (PFA; em solução salina tamponada com fosfato [PBS] de pH = 7,4).</li>
	<li>Dissecção do tecido cerebral.<ol><li>Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura para fazer um corte na área cervical. Use a tesoura para remover a pele e, em seguida, corte o osso do crânio ao longo da linha média sagital, com as pontas da tesoura apontando para cima, a fim de não danificar o tecido cerebral. Procure continuar cortando o máximo possível, passando a linha média coronal.</li>
		<li>Use pinças para remover os ossos, começando pelos ossos supraoccipital e parietal e, finalmente, os ossos frontais.</li>
		<li>Uma vez que o tecido cerebral é revelado, use a pinça ou uma espátula para retirá-lo do crânio. Para facilitar isso, corte os nervos na base do cérebro e os bulbos olfativos, se não quiser.</li>
	</ol></li>
	<li>Pós-fixar o tecido durante a noite em PFA a 2% a 4 °C.</li>
	<li>Crio-proteger o tecido em sacarose a 30% (em PBS) por pelo menos 48 h a 4 °C até que o tecido afunde para o fundo.</li>
	<li>Congelar o tecido a -80 °C.</li>
	<li>Cortar o tecido cerebral em cortes coronais de 14 μm de espessura com um criostato.</li>
	<li>Realizar coloração por imunofluorescência utilizando protocolos padronizados 3,7<ol><li>Incubar os cortes com tampão de bloqueio (albumina de soro bovino a 3% [BSA], Triton X-100 a 0,1%, em PBS) por 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Realizar recuperação antigênica (fervura por 15 min em tampão citrato 10 mM, pH = 6,0, utilizando frascos de vidro). NOTA: Esta etapa é opcional, mas necessária para antígenos nucleares.</li>
		<li>Levar à temperatura ambiente e incubar com anticorpos primários contra proteína glial fibrilar ácida (GFAP), doublecortin (Dcx), S100β e β-catenina (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C.</li>
		<li>Incubar durante 2 h com anticorpos secundários em PBS com 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para contramarcação nuclear à temperatura ambiente (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Monte as lamínulas.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Processamento de células isoladas para imunofluorescência
<ol><li>Placatear as células em placas de 96 poços compatíveis para microscopia, revestidas com poli-D-lisina (100 μg/mL).</li>
	<li>Fixar as células em PFA a 2% gelado por 10 min e lavar 3x com PBS.</li>
	<li>Realizar imunofluorescência usando procedimentos padrão3,7 para PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 e ID3 (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Manter as células em PBS + NaN3 (0,1%) a 4 °C no escuro.</li>
</ol>6. Microscopia e análise de imagens
<ol><li>Tire imagens usando epifluorescência ou microscopia confocal e realize contagens de células usando ferramentas padrão de software de análise de imagem, como contadores de células.</li>
</ol>

"Ordenha cerebral" de rato para isolamento de células-tronco neurais e oligodendrócitos

<ol>
	<li>Visvader, J. E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+designs+of+stem+cell+hierarchies.">Tissue-specific designs of stem cell hierarchies.</a> Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).</li><li>Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+quiescent+and+active+neural+stem+cells+in+the+postnatal+brain.">Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain.</a> The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).</li><li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subependymal+zone-derived+oligodendroblasts+respond+to+focal+demyelination+but+fail+to+generate+myelin+in+young+and+aged+mice.">Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).</li><li>Franklin, R. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP2+in+ependymal+cells+regulates+BMP+signaling+in+the+adult+neurogenic+niche.">LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche.</a> Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse a declarar.

As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas característi...

As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dostecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes2. No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas em áreas especializadas, muitas vezes chamadas de nichos. Duas dessas áreas bem descritas existem na zona subependimária (ZEE) dos ventrículos laterais e no giro denteado do hipocampo. O nicho SEZ gera o maior número de células, principalmente neuroblastos que migram em direção aos bulbos olfativos e contribuem para a população local de interneurônios; em contraste, os oligodendroblastos gerados migram para o corpo caloso adjacente (CC)3. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) são células mitoticamente ativas, amplamente distribuídas pelo sistema nervoso central, que: i) estão comprometidas com a linhagem oligodendroglial, ii) podem migrar para sítios de desmielinização e iii) podem se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes. OPCs também apresentam potencial de auto-renovação e quiescência4.
Até agora, o isolamento e o estudo de NSCs e OPCs exigiam a dissociação post-mortem do tecido cerebral e medular dissecado. Para contornar essa limitação experimental, estabelecemos um método que permite, pela primeira vez, o isolamento de NSCs e OPCs cerebrais de animais vivos. Chamamos esse método de "ordenha", porque ele permite várias coletas de células, pois seus pools não se esgotam. O protocolo foi desenvolvido em ratos, devido ao seu grande tamanho cerebral, visando principalmente a ZEE, ou CC, e inclui duas etapas principais. Primeiro, NSCs ou OPCs são "removidos" do tecido por meio da injeção i.c.v. de um "coquetel de liberação" contendo neuraminidase, uma toxina que induz desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador de integrina-β1 e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O coquetel é injetado estereotaxicamente bilateralmente dentro dos ventrículos laterais. Se o uso pretendido for o isolamento de NSCs, áreas rostrais dos ventrículos laterais são alvo. Se o objetivo é isolar OPCs mais puramente, o coquetel é injetado caudalmente na área da fímbria hipocampal. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano (LCR) são realizadas a partir da cisterna magna de ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão. A biópsia líquida é misturada com meio de cultura NSC e pode ser mantida a 4 °C até o plaqueamento.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Release cocktail</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;1-integrin-blocking antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>#555002</td>
			<td>purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#N2876</td>
			<td>Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#100-18B</td>
			<td>kept as a 1 &#956;g/&#956;L stock, diluted in sterile water at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical procedures</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>#80330</td>
			<td>Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Micro-fine 1 mL insulin syringes</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>04085-00</td>
			<td>29 G x 12.7 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML</td>
			<td>LAVIPHARM-CASTALIA</td>
			<td>SKU: 5201048131168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupaq</td>
			<td>RICHTERPHARMA</td>
			<td>1021854AF</td>
			<td>10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic Monitoring System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid</td>
			<td>Vetpharma Animal Health</td>
			<td>32509/4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamidor</td>
			<td>RICHTER PHARMA</td>
			<td>SKU: 9004114002531</td>
			<td>Ketamine 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture, Ethilon</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>D9635</td>
			<td>Clear , size 5-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rechargeable Cordless Surgical Trimmers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Item:51472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades, sterile</td>
			<td>Swann Morton</td>
			<td>AW050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scopettes Jr.&#160; 8-inch Swabs</td>
			<td>Birchwood Laboratories</td>
			<td>34-7021-12P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic High Speed Drill</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>1474w/o1464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stoelting&#8217;s Stereotaxic Instrument Kit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>Item: 52189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylan 2%</td>
			<td>Chanelle Pharmaceuticals</td>
			<td>13764/03/19-5-2004</td>
			<td>Xylazine, 25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue and cells handling and immunostainings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates appropriate for microscopy</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#655866</td>
			<td>Screen star microplate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1486701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P06-1391100</td>
			<td>Fraction V, heat shock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71497</td>
			<td>Sodium citrate monobasic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Merck, Calbiochem</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td>Nuclear staining, Dilution: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11995065</td>
			<td>High glucose, pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-goat</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20016 or 20106 or 20048</td>
			<td>Dilution: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-mouse</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20014 or 20105 or 20046</td>
			<td>Dilution: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-rabbit</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20015 or 20098 or 20047</td>
			<td>Dilution: 1/1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-2 (or bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-GFAP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab53554</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-SOX2</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-17320</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-ID3</td>
			<td>Santa Cruz Biotecnology</td>
			<td>sc-56712</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-S100&#946;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2532</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Merck, Calbiochem</td>
			<td>475904</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmadehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Merck, Millipore</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td>Solution, 1.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Doublecortin (DCX)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18723</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-PDGFR&#945;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51875</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-&#946;- catenin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab16051</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy and image analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP6 and SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LasX</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the "brain milking" method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from live rats

As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.
Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a "ordenha cerebral", um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são "liberadas" do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um "coquetel de liberação". Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de "coleta", biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.
Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.

Tissue-specific stem cells are partially committed cells that can give rise to all cell populations that constitute the respective tissues. Apart from being multipotent, they are self-renewing cells and crucial for maintaining the homeostasis and the regenerative capacity of tissues1. Some tissue-specific stem cells remain in an active, strongly proliferative state, such as intestinal or hematopoietic stem cells. Others, such as brain stem cells, remain largely quiescent or dormant2. In the adult brain, neural stem cells (NSCs) can be found in specialized areas, often called niches. Two such well described areas exist in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles and in the dentate gyrus of the hippocampus. The SEZ niche generates the highest numbers of cells, primarily neuroblasts that migrate toward the olfactory bulbs and contribute to the local interneuron population; in contrast, generated oligodendroblasts migrate to the adjacent corpus callosum (CC)3. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are mitotically active cells, widely distributed throughout the central nervous system, that: i) are committed to the oligodendroglial lineage, ii) can migrate to sites of demyelination, and iii) can differentiate into myelinating oligodendrocytes. OPCs also exhibit self-renewal potential and quiescence4.
Until now, the isolation and study of NSCs and OPCs required postmortem dissociation of the dissected brain and spinal cord tissue. To circumvent this experimental limitation, we established a method that allows, for the first time, the isolation of brain NSCs and OPCs from live animals. We call this method &#34;milking&#34;, because it enables multiple collections of cells as their pools are not depleted. The protocol was developed in rats, due to their large brain size, targeting mainly the SEZ, or the CC, and includes two major steps. First, NSCs or OPCs are &#34;removed&#34; from the tissue via i.c.v. injection of a &#34;release cocktail&#34; containing neuraminidase, a toxin that induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor 2 (FGF2). The cocktail is stereotaxically injected bilaterally within the lateral ventricles. If the intended use is the isolation of NSCs, rostral areas of the lateral ventricles are targeted. If the aim is to isolate OPCs more purely, the cocktail is injected caudally in the area of the hippocampal fimbria. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid (CSF) are performed from the cisterna magna of anesthetized rats, without the need of an incision. The liquid biopsy is mixed with NSC culture medium and can be kept at 4 &#176;C until plating.

Autor em destaque: Coletando células-tronco neurais e progenitoras de animais vivos usando um novo protocolo de ordenha cerebral 

Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

We are working with brain neural stem cells, very sparse cells that cluster within specialized microenvironments called niches. Although they contribute to olfaction, memory, and learning, they are extremely inefficient in driving regeneration. Thus, we investigate their properties and ways to manipulate them to increase the healing of the nervous tissue.We have shown that the contribution of brain neural stem cells to regeneration is limited by endogenous and endogenous factors, such as their restricted differentiation potential, and their dependence on microenvironment factors. Equally, we have identified key properties that can be used to devise strategies to modulate their capacity. The milking protocol allows the collection of brain neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from live experimental animals.Thus, it allows a more uninterrupted analysis of their properties and the performance of longitudinal studies. Currently, there are no alternative techniques for the isolation of brain murine stem and progenitor cells from live experimental animals. The present standard of comparison is the postmortem isolation of such cells, which introduces various experimental uncertainties and biological bias.We are now investigating how brain neural stem cells become activated by existing quiescence. We are also comparing the properties of different progenitor populations of the brain. For example, neurogenic versus oligodendrogenic, in order to define their differential properties and their adaptations to varied microenvironment.

Lançamento e coleta de NSCs As NSCs da ZEE são separadas do LCR apenas pela monocamada de células ependimárias, embora permaneçam em contato direto com o conteúdo ventricular por meio de processos monociliados intercalantes 8,9. A neuraminidase age especificamente nas células ependimárias via clivagem de resíduos de ácido siálico e pode induzir desnudamento da parede ventricular. Isso leva ao agrupamento de neurobl...

Watch this Scientific Journal Video about Collecting Neural Stem and Progenitor Cells from Live Animals Using a Novel Brain Milking Protocol at JoVE.com

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

Estamos trabalhando com células-tronco neurais cerebrais, células muito esparsas que se agrupam dentro de microambientes especializados chamados nichos. Embora contribuam para o olfato, memória e aprendizagem, são extremamente ineficientes na regeneração da condução. Assim, investigamos suas propriedades e formas de manipulá-las para aumentar a cicatrização do tecido nervoso.Mostramos que a contribuição das células-tronco neurais cerebrais para a regeneração é limitada por fatores endógenos e endógenos, tais como seu potencial de diferenciação restrito e sua dependência de fatores do microambiente. Igualmente, identificamos propriedades-chave que podem ser usadas para elaborar estratégias para modular sua capacidade. O protocolo de ordenha permite a coleta de células-tronco neurais cerebrais e células progenitoras de oligodendrócitos de animais experimentais vivos.Assim, permite uma análise mais ininterrupta de suas propriedades e a realização de estudos longitudinais. Atualmente, não existem técnicas alternativas para o isolamento de células-tronco e progenitoras do cérebro murino de animais experimentais vivos. O presente padrão de comparação é o isolamento post-mortem dessas células, o que introduz várias incertezas experimentais e viés biológico.Estamos agora investigando como as células-tronco neurais cerebrais se tornam ativadas pela quiescência existente. Também estamos comparando as propriedades de diferentes populações progenitoras do cérebro. Por exemplo, neurogênicos versus oligodendrogênicos, a fim de definir suas propriedades diferenciais e suas adaptações a microambientes variados.

the-brain-milking-method-for-isolation-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

1.3K visualizações.  University of Patras. Estamos trabalhando com células-tronco neurais cerebrais, células muito esparsas que se agrupam dentro de microambientes especializados chamados nichos. Embora contribuam para o olfato, memória e aprendizagem, são extremamente ineficientes na regeneração da condução. Assim, investigamos suas propriedades e formas de manipulá-las para aumentar a cicatrização do tecido nervoso.Mostramos que a contribuição das células-tronco neurais cerebrais para a regeneração é limitada...

Vídeo: Autor em destaque: Coletando células-tronco neurais e progenitoras de animais vivos usando um novo protocolo de ordenha cerebral 

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new neurons and glia. One such niche is the subependymal zone (SEZ; also called the ventricular-subventricular zone), which is located across the lateral walls of the lateral ventricles, adjacent to the ependymal cell layer. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) are abundantly distributed throughout the central nervous system, constituting a pool of proliferative progenitor cells that can generate oligodendrocytes.
Both NSCs and OPCs exhibit self-renewal potential and quiescence/activation cycles. Due to their location, the isolation and experimental investigation of these cells is performed postmortem. Here, we describe in detail &#34;brain milking&#34;, a method for the isolation of NSCs and OPCs, amongst other cells, from live animals. This is a two-step protocol designed for use in rodents and tested in rats. First, cells are &#34;released&#34; from the tissue via stereotaxic intracerebroventricular (i.c.v.) injection of a &#34;release cocktail&#34;. The main components are neuraminidase, which targets ependymal cells and induces ventricular wall denudation, an integrin-&#946;1-blocking antibody, and fibroblast growth factor-2. At a second &#34;collection&#34; step, liquid biopsies of cerebrospinal fluid are performed from the cisterna magna, in anesthetized rats without the need of an incision.
Results presented here show that isolated cells retain their endogenous profile and that NSCs of the SEZ preserve their quiescence. The denudation of the ependymal layer is restricted to the anatomical level of injection and the protocol (release and collection) is tolerated well&#160; by the animals. This novel approach paves the way for performing longitudinal studies of endogenous neurogenesis and gliogenesis in experimental animals.

A method for the isolation of neural stem cells and oligodendrocyte progenitor cells from the brains of live rats is presented here in experimental detail. It allows multiple collections of these cells from the same animals without compromising their well-being.