Ce travail a été financé par la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LY22H020005) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81873466).

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université médicale de Wenzhou (XMSQ2021-0057, 19juillet 2021). Tous les réactifs et consommables sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation du milieu de culture
<ol><li>10 milieux de culture M199 : Dissoudre la poudre M199 à une concentration 10x avec 90 mL d’eau désionisée et ajouter 10 mL de sérum fœtal bovin (FBS), puis passer à travers un filtre de 0,22 μm. Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 2 mois.</li>
	<li>Milieu de culture endothélial complet : Ajouter 50 mL de FBS, 5 mL de pénicilline/streptomycine et 5 mL de supplément de croissance des cellules endothéliales à 460 mL de milieu de cellules endothéliales (MEC). Conservez le milieu à 4 °C jusqu’à 1 mois.</li>
</ol>2. Préparation des cellules vasculaires
<ol><li>Cultiver 1 x 105 cellules vasculaires (cellules progénitrices endothéliales primairescultivées 14, cellules endothéliales ou lignées cellulaires endothéliales) avec 8 mL de milieu de culture endothélial complet dans une boîte de culture tissulaire de 100 mm à 37 °C et 5 % de CO2 à 70 % de confluence.</li>
	<li>Retirez le milieu de culture et rincez la boîte 2 fois avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer les cellules non attachées et les débris. Retirer le PBS et ajouter 3 mL de trypsine à 0,25 % contenant 2,21 mM d’EDTA, et incuber à 37 °C pendant 1 min.</li>
	<li>Neutraliser la trypsine avec 7 ml de milieu de culture endothélial complet et rincer délicatement les cellules de la boîte de culture. Confirmez le décollement cellulaire au microscope optique (grossissement de 40x).</li>
	<li>Prélever la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à 400 x g pendant 10 min. Retirer les cellules surnageantes et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu de culture endothélial complet.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et déplacer la suspension contenant 2 x 106 cellules dans un tube stérile de 1,5 ml. Chaque bouchon contient 1,5 x 106 cellules, 25% de cellules supplémentaires sont utilisées en cas de gaspillage. Chaque groupe comprend au moins 3 prises. NOTE : Après des essais, il a été constaté que 1,5 x 106 cellules dans 300 μL de gel matriciel conduisaient au développement correct de l’angiogenèse et ont donc été choisies pour l’expérimentation.</li>
	<li>Centrifuger la suspension cellulaire à 400 x g pendant 5 min pour granuler les cellules, puis éliminer le surnageant.</li>
</ol>3. Préparation du gel matriciel
<ol><li>Pré-refroidir des tubes stériles de 1,5 mL contenant des pastilles de cellules dans un bain-marie à 4 °C. Pré-refroidir les seringues à insuline de 30 G et 1 mL dans un réfrigérateur à 4 °C.</li>
	<li>Décongeler complètement le gel matriciel au bain-marie à 4 °C. Ne pas mélanger ou vortex. Pré-refroidissez 10x M199 et testez le réactif/médicament d’intérêt dans un bain-marie à 4 °C.</li>
	<li>Mélanger un gel matriciel pré-refroidi avec 10x M199 contenant 10% de FBS et le réactif à tester à un rapport volumique de 8,8:1:0,2 pour obtenir un gel matriciel et un mélange M199 contenant 1% de FBS et le réactif.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules avec 400 μL du mélange de gel matriciel, mélanger doucement pour éviter la formation de bulles. Gardez le tube sur de la glace jusqu’à ce que les souris soient prêtes pour l’injection. Gardez le mélange de gel matriciel sur de la glace tout le temps pour éviter la coagulation. REMARQUE : Ici, 300 μL de mélange de gel matriciel contenant 1,5 x 106 cellules ont été utilisés pour former un bouchon de gel. Préparez 25 % de gel supplémentaire selon 25 % de cellules supplémentaires à l’étape 2.</li>
</ol>4. Préparation de la souris
<ol><li>Anesthésier une souris Nu/Nu mâle de 6 à 8 semaines (18 à 25 g) dans la chambre de l’appareil d’anesthésie animale avec de l’isoflurane (3 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min). Après une anesthésie réussie, confirmée par l’absence de réflexe de redressement et de réflexe de pincement des orteils, sortir la souris de la chambre, sortir la souris de la chambre et mettre un masque d’anesthésie sur la souris et modifier la concentration d’isoflurane à 1,5 % dans 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min. REMARQUE : Fournir un soutien thermique à l’animal à l’aide d’un coussin chauffant tout au long de la procédure.</li>
	<li>Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Collez les membres des souris sur le tableau d’opération en position couchée.</li>
</ol>5. Injection de mélange de gel matriciel
<ol><li>Chargez 300 μL du mélange de gel matriciel dans une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 30 G. Évitez la formation de bulles. Chargez rapidement le gel matriciel (dans les 2 minutes) pour éviter la solidification pendant ce temps. Placez immédiatement la seringue à insuline chargée de gel matriciel sur de la glace.</li>
	<li>Nettoyez la peau du dos des souris à l’aide de tampons d’alcool à 75 %. Injecter par voie sous-cutanée 300 μL de mélange de gel matriciel dans un côté du dos des souris.</li>
	<li>Retirez délicatement l’aiguille du site d’injection pour éviter toute fuite du mélange de gel matriciel. Vérifiez s’il y a une petite bosse au site d’injection (figure 1).</li>
	<li>Placez la souris sur le coussin chauffant pendant 2 min pour laisser le mélange de gel matriciel coaguler et former un bouchon.</li>
	<li>Répétez les étapes 5.2. à 5.4. pour créer une prise de l’autre côté de l’arrière de la souris. Marquez les bords des bosses à l’aide d’un marqueur.</li>
	<li>Observez la souris jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Mettez la souris dans une cage séparée jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. Hébergez les souris dans un laboratoire d’animaux de laboratoire de classe SPF à 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures pendant 7 jours.</li>
</ol>6. Injection de Dextran-FITC par la veine de la queue
<ol><li>Après 7 jours d’injection de gel matriciel, remettre en suspension 0,5 mg de dextran-FITC avec 500 μL d’eau doublement distillée (ddH2O) puis agiter violemment pour obtenir la solution de dextran-FITC à la concentration finale de 1 μg/μL. REMARQUE : Utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~150 kDa pour le test d’angiogenèse, et utilisez le dextran-FITC avec une masse moléculaire de ~4 kDa pour le test de perméabilité vasculaire.</li>
	<li>Chargez 50 μL de solution de dextran-FITC dans les seringues 29G.</li>
	<li>Fixez la souris sur l’instrument d’injection de la veine caudale. Nettoyez la queue avec une boule de coton à 75 % d’alcool et injectez doucement 50 μL de dextran-FITC par la veine de la queue.</li>
	<li>Comprimez le site d’injection avec un coton-tige pendant 1 min pour arrêter le saignement, puis remettez les souris dans la cage pendant 30 min.</li>
	<li>Répétez les étapes 6.3. et 6.4. jusqu’à ce que toutes les souris aient reçu une injection de dextran-FITC.</li>
</ol>7. Collection de bouchons de gel matriciels
<ol><li>Injecter par voie intrapéritonéale 1 % de pentobarbital sodique dans du PBS (200 mg/kg de poids corporel) et euthanasier les souris selon une procédure approuvée par l’IACUC.</li>
	<li>Coupez la peau le long du bord marqué du bouchon à l’aide de ciseaux chirurgicaux et retirez la peau au-dessus du bouchon de gel matriciel.</li>
	<li>Récupérez le bouchon et rincez-le dans un petit bécher avec 1x PBS pour éliminer l’excès de sang (Figure 2A). La couleur du bouchon peut délimiter approximativement le degré d’abondance du sang et le contenu des néo-vaisseaux (Figure 3A).</li>
</ol>8. Enrobage de la matrice de la fiche de gel et préparation de la section
<ol><li>Couvrez le bouton de la cassette d’enrobage tissulaire avec environ 0,5 mL de gel d’enrobage tissulaire, puis placez immédiatement le bouchon de gel matriciel sur le gel d’enrobage tissulaire dans l’orientation souhaitée, comme indiqué à la figure 2B. Ensuite, intégrez le bouchon avec du gel d’enrobage de tissu supplémentaire.</li>
	<li>Mettez les cassettes au congélateur à -80 °C pendant 12 h pour qu’elles se solidifient.</li>
	<li>Pour la préparation de coupes épaisses, retirez le bloc de bouchon solidifié et coupez des sections de 12 μm d’épaisseur à l’aide du microtome de congélation selon les instructions, puis montez sur des lames de microscope.</li>
	<li>Coupez 5 à 10 sections de chaque bloc de bouchons.</li>
</ol>9. Quantification de l’angiogenèse (Figure 3)
<ol><li>Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 10x.</li>
	<li>Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J (https://imagej.en.softonic.com/) et cliquez sur le bouton Analyser l’angiogenèse . Ensuite, cliquez sur le bouton Analyser le contraste de phase HUVEC et passez au tableau des résultats des statistiques pour recueillir des informations. Mesurez les 5 images de fluorescence acquises pour chaque section.</li>
	<li>Analyser la longueur totale des néo-vaisseaux de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence d’angiogenèse entre ces groupes. NOTA : La longueur totale des segments maîtres indique la longueur totale des néo-navires. Le réactif qui augmente la longueur des néo-vaisseaux est appelé pro-angiogénique, tandis que le réactif qui diminue la longueur des néo-vaisseaux est anti-angiogénique.</li>
</ol>10. Quantification de la perméabilité vasculaire (Figure 4)
<ol><li>Acquérir des images de fluorescence à partir de 5 champs indépendants de la coupe avec un microscope à fluorescence inversée à une longueur d’onde de 488 nm sous un grossissement de 20x.</li>
	<li>Ouvrez le fichier image avec le logiciel Image J. Cliquez sur le bouton Sélection à main levée et encerclez la zone de fuite, puis cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez l’option Mesurer pour obtenir les informations sur la zone de fuite. Utilisez le rapport entre la zone de fuite et la zone de l’image pour indiquer la perméabilité vasculaire.</li>
	<li>Analyser le rapport entre la zone de fuite et la surface de l’image de différents groupes pour évaluer statistiquement la différence de perméabilité vasculaire entre ces groupes.</li>
</ol>

Simplification des études d’angiogenèse avec un dosage à matrice modifiée

<ol>
	<li>Bikfalvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+and+conceptual+developments+in+vascular+biology+and+angiogenesis+research:+a+personal+view.">History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view.</a> Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).</li><li>Carmeliet, P., Jain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+vessel+normalization+for+cancer+and+other+angiogenic+diseases.">Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases.</a> Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).</li><li>De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+tumour+angiogenesis.">Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis.</a> Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).</li><li>Griffioen, A., Molema, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+potentials+for+pharmacologic+intervention+in+the+treatment+of+cancer,+cardiovascular+diseases,+and+chronic+inflammation.">Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation.</a> Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).</li><li>Viallard, C., Larriv&#233;e, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+vascular+normalization:+alternative+therapeutic+targets.">Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets.</a> Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).</li><li>Craig, M., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+transcription+factors+in+embryonic+vascular+development.">ETS transcription factors in embryonic vascular development.</a> Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).</li><li>Losordo, D., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+angiogenesis+and+vasculogenesis+for+ischemic+disease.+Part+I:+angiogenic+cytokines.">Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines.</a> Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-angiogenesis-new+concept+for+therapy+of+solid+tumors.">Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors.</a> Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer,+vascular,+rheumatoid+and+other+disease.">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opinion+-+Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Fan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1&#946;+augments+the+angiogenesis+of+endothelial+progenitor+cells+in+an+NF-&#954;B/CXCR7-dependent+manner.">Interleukin-1&#946; augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-&#954;B/CXCR7-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).</li><li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nrf2+transcriptional+upregulation+of+IDH2+to+tune+mitochondrial+dynamics+and+rescue+angiogenic+function+of+diabetic+EPCs.">Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs.</a> Redox Biology. 56, 102449 (2022).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liraglutide+Improves+the+Angiogenic+Capability+of+EPC+and+Promotes+Ischemic+Angiogenesis+in+Mice+under+Diabetic+Conditions+through+an+Nrf2-Dependent+Mechanism.">Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism.</a> Cells. 11 (23), 3821 (2022).</li><li>Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).</li><li>Malinda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+matrigel+migration+and+angiogenesis+assay.">In vivo matrigel migration and angiogenesis assay.</a> Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).</li><li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays.">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF21+promotes+ischaemic+angiogenesis+and+endothelial+progenitor+cells+function+under+diabetic+conditions+in+an+AMPK/NAD+-dependent+manner.">FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).</li><li>Gavard, J., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+controls+endothelial-cell+permeability+by+promoting+the+beta-arrestin-dependent+endocytosis+of+VE-cadherin.">VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin.</a> Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).</li><li>Birdsey, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+transcription+factor+ERG+promotes+vascular+stability+and+growth+through+Wnt/&#946;-catenin+signaling.">The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/&#946;-catenin signaling.</a> Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).</li><li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+CXCR4+antagonist+enhances+angiogenesis+via+modifying+the+ischaemic+tissue+environment.">A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Nous présentons une méthode fiable et pratique pour l’évaluation quantitative de l’angiogenèse in vivo sans coloration. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu pour former un bouchon de gel (Figure 1). Après 7 jours de formation d’un bouchon de gel, le dextran-FITC a été injecté par voie in...

L’angiogenèse, le processus de formation de néo-vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants, joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, l’athérosclérose, le développement tumoral, etc.1,2,3,4,5. Ce processus dynamique implique plusieurs étapes, dont la dégradation de la matrice, la prolifération des cellules vasculaires, la migration et l’auto-organisation pour former des structures tubulaires et la stabilisation des néo-vaisseaux6. Il a été démontré que la promotion de l’angiogenèse est essentielle dans le traitement de l’infarctus du myocarde, des accidents vasculaires cérébraux et d’autres types de maladies ischémiques7, tandis que l’inhibition de l’angiogenèse a été considérée comme une stratégie prometteuse dans le traitement des cancers8 et des maladies rhumatoïdes9. L’angiogenèse a été considérée comme un principe organisateur de la découverte de médicaments10. Ainsi, la construction d’une méthode fiable et pratique pour évaluer l’étendue de l’angiogenèse est essentielle pour la recherche mécanique ou la découverte de médicaments dans les maladies dépendantes de l’angiogenèse.
Plusieurs modèles in vitro et in vivo ont été développés pour évaluer l’angiogenèse11. Parmi ceux-ci, les modèles bidimensionnels (2D), comme le test de formation de tubes de gelmatriciel 12, ne peuvent pas former de structures tubulaires fonctionnelles. Les modèles animaux, tels que le modèle d’ischémie des membres postérieurs13,14, peuvent reproduire le processus d’angiogenèse mais sont complexes et nécessitent un système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser. Les modèles 3D de morphogenèse vasculaire, comme le test du bouchon de gel matriciel, fournissent une plate-forme simple qui peut imiter le processus d’angiogenèse in vivo15, mais la détection de l’angiogenèse nécessite une immunohistochimie ou une coloration par immunofluorescence 16,17,18, qui sont variables et mal visualisées.
Ici, nous décrivons un protocole pour un test de bouchon de gel matriciel modifié où les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel et injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris pour former un bouchon. Dans le bouchon, les cellules vasculaires doivent dégrader la matrice, proliférer, migrer et s’auto-organiser pour finalement former des vaisseaux fonctionnels avec un flux sanguin dans l’environnement interne. Par la suite, du dextran fluorescent est injecté par la veine de la queue, pour s’écouler à travers le bouchon, et l’étiquette est visualisée pour indiquer les néo-vaisseaux. Le contenu de l’angiogenèse peut être évalué quantitativement par la longueur des vaisseaux. Cette méthode peut former des vaisseaux fonctionnels qui ne peuvent pas être produits dans les modèles d’angiogenèse 2D12, et ne nécessite pas de processus de coloration complexe comme dans le test ordinaire de bouchon de gelmatriciel 11. Il ne nécessite pas non plus d’instruments spécifiques coûteux comme le système d’imagerie du flux sanguin par chatoiement laser dans l’ischémie des membres postérieurs modèle 13,14,19. Cette méthode est polyvalente, peu coûteuse, quantifiable et facile à réaliser, et peut être utilisée pour déterminer la capacité pro- ou anti-angiogénique des médicaments ou être utilisée dans la recherche mécanique impliquée dans l’angiogenèse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesion Microscope Slides</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia System</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R640-S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryoslicer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>CryoStar NX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-150kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrans-FITC-4kDa</td>
			<td>WEIHUA BIO</td>
			<td>WH007N0705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding Cassettes</td>
			<td>CITOTEST</td>
			<td>80203-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Medium</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>35809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Growth Supplements</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td>1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100147C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast Growth Factor 1</td>
			<td>AtaGenix</td>
			<td>9043p-082318-A01</td>
			<td>FGF1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ni</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Boruida</td>
			<td>30-50-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-22-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory&#160;Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199 powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31100-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound</td>
			<td>SUKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td>Tissue embedding gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitate Acid</td>
			<td>KunChuang</td>
			<td>KC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Liquid</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Instruments</td>
			<td>RWD</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tail Vein Injection Instrument</td>
			<td>KEW BASIS</td>
			<td>KW-XXY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>T1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Temperature Freezer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>U410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Endothelial Growth Factor</td>
			<td>CHAMOT</td>
			<td>CM058-5HP</td>
			<td>VEGF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified in vivo matrix gel plug assay for angiogenesis studies

Plusieurs modèles ont été développés pour étudier l’angiogenèse in vivo. Cependant, la plupart de ces modèles sont complexes et coûteux, nécessitent un équipement spécialisé ou sont difficiles à réaliser pour une analyse quantitative ultérieure. Nous présentons ici un test de bouchon de gel matriciel modifié pour évaluer l’angiogenèse in vivo. Dans ce protocole, les cellules vasculaires ont été mélangées à du gel matriciel en présence ou en l’absence de réactifs pro-angiogéniques ou anti-angiogéniques, puis injectées par voie sous-cutanée dans le dos de souris receveuses. Après 7 jours, une solution saline tampon phosphate contenant du dextran-FITC est injectée par la veine de la queue et circule dans des vaisseaux pendant 30 min. Des bouchons de gel matriciel sont collectés et intégrés dans du gel d’enrobage tissulaire, puis des sections de 12 μm sont découpées pour la détection par fluorescence sans coloration. Dans ce test, le dextran-FITC de haut poids moléculaire (~150 000 Da) peut être utilisé pour indiquer les vaisseaux fonctionnels pour détecter leur longueur, tandis que le dextran-FITC de faible poids moléculaire (~4 400 Da) peut être utilisé pour indiquer la perméabilité des néo-vaisseaux. En conclusion, ce protocole peut fournir une méthode fiable et pratique pour l’étude quantitative de l’angiogenèse in vivo.

Angiogenesis, the process of formation of neo-vessels from pre-existing vessels, plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development, wound healing, atherosclerosis, tumor development, etc.1,2,3,4,5. This dynamic process involves several steps, including the degradation of the matrix, vascular cell proliferation, migration and self-organization to form tubular structures and the stabilization of the neo-vessels6. Promoting angiogenesis has been demonstrated to be critical in the treatment of myocardial infarction, stroke and other kinds of ischemic diseases7 while inhibiting angiogenesis has been considered a promising strategy in the treatment of cancers8 and rheumatoid diseases9. Angiogenesis has been considered an organizing principle for drug discovery10. Thus, the construction of a reliable and convenient method to assess the extent of angiogenesis is critical for mechanical research or drug discovery in angiogenesis-dependent diseases.
Several in vitro and in vivo models have been developed to evaluate angiogenesis11. Among these, two-dimensional (2-D) models, like matrix gel tube formation assay12, cannot form functional tubular structures. The animal models, such as the hind limb ischemia model13,14, can reproduce the angiogenesis process but are complex and require a laser speckle blood flow imaging system. 3D models of vascular morphogenesis, like matrix gel plug assay, provide a simple platform that can mimic the process of angiogenesis in vivo15, but the detection of angiogenesis requires immunohistochemistry or immunofluorescence staining16,17,18, which are variable and poorly visualized.
Here, we describe a protocol for a modified matrix gel plug assay where vascular cells were mixed with matrix gel and subcutaneously injected into the back of mice to form a plug. In the plug, vascular cells need to degrade the matrix, proliferate, migrate, and self-organize to finally form functional vessels with blood flow in the internal environment. Thereafter, fluorescent-labeled dextran is injected via the tail vein, to flow through the plug, and the label is visualized to indicate neo-vessels. The content of angiogenesis can be quantitatively evaluated by the length of the vessels. This method can form functional vessels that cannot be produced in 2-D angiogenesis models12, and does not need complex stain process as in ordinary matrix gel plug assay11. It also does not require expensive specific instruments like laser speckle blood flow imaging system in hind limb ischemia model13,14,19. This method is versatile, low-cost, quantifiable, and easy to perform, and can be used to determine the pro- or anti-angiogenic capability of drugs or be used in mechanical research involved in angiogenesis.

Pleins feux sur l’auteur : Étude de l’angiogenèse et de la perméabilité des vaisseaux à l’aide d’un dosage du bouchon de gel matriciel modifié

Essai de bouchon de gel matriciel in vivo modifié pour les études d’angiogenèse

Our research deals with angiogenesis, the process of formation of new vessels from preexisting vessels. It plays a critical role in many physiological and pathological processes, such as embryonic development or curing atherosclerosis, tumor development, etc. The construction of a reliable model to evaluate the extent of angiogenesis is critical for myocardial research or the discovery of medicines for angiogenesis-depend diseases.However, most of the existing models are complex, expensive, and require specialized equipment. Here, we present a modified matrix gel plug assay that can be used to investigate angiogenesis and vessel permeability without staining in a simple, more intuitive, as well as efficient manner.

La figure 1 est l’organigramme illustrant comment préparer le mélange de gel matriciel, de cellules vasculaires, de milieu de culture et de réactif. Le mélange a ensuite été injecté par voie sous-cutanée dans le dos de souris Nu/Nu et chauffé à l’aide d’un coussin chauffant pour accélérer sa coagulation et finalement former un bouchon de gel.
La figure 2A est l’organigramme permettant d’indiquer les récipients c...

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La méthode présentée ici permet d’évaluer l’effet des réactifs sur l’angiogenèse ou la perméabilité vasculaire in vivo sans coloration. La méthode utilise l’injection de dextran-FITC via la veine de la queue pour visualiser les néo-vaisseaux ou les fuites vasculaires.

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

Nos recherches portent sur l’angiogenèse, le processus de formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants. Il joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire ou la guérison de l’athérosclérose, le développement tumoral, etc. La construction d’un modèle fiable pour évaluer l’étendue de l’angiogenèse est essentielle pour la recherche myocardique ou la découverte de médicaments pour les maladies dépendantes de l’angiogenèse.Cependant, la plupart des modèles existants sont complexes, coûteux et nécessitent un équipement spécialisé. Ici, nous présentons un test de bouchon de gel matriciel modifié qui peut être utilisé pour étudier l’angiogenèse et la perméabilité des vaisseaux sans coloration d’une manière simple, plus intuitive et plus efficace.

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Research

JoVE Journal

Biology

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

554 vues.  Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University. Nos recherches portent sur l’angiogenèse, le processus de formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux préexistants. Il joue un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques, tels que le développement embryonnaire ou la guérison de l’athérosclérose, le développement tumoral, etc. La construction d’un modèle fiable pour évaluer l’étendue de l’angiogenèse est essentielle pour la recherche myocardique ou la découverte de médicaments p...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Étude de l’angiogenèse et de la perméabilité des vaisseaux à l’aide d’un dosage du bouchon de gel matriciel modifié

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Recherche

Biologie

Preparing Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

Begin by preparing the complete endothelial culture medium using 460 milliliters of endothelial cell medium, and adding into it, 50 milliliters of FBS, five milliliters of penicillin streptomycin, and five milliliters of endothelial cell growth supplement. The prepared media can be stored at four degrees celsius for a month. Next, in a 100 millimeter tissue culture dish containing 0.1 million vascular cells at eight milliliters of the prepared complete endothelial culture medium and culture the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide until 70%co-fluency is achieved.Then, remove the culture medium from the dish and rinse the cells twice with PBS to eliminate unattached cells and debris. After removing the PBS, add three milliliters of 0.25%trypsin, containing 2.21 millimolar EDTA to the cells and incubate the dish at 37 degrees Celsius for one minute. Verify cell detachment under a light microscope at 40 times magnification.Neutralize the trypsin with seven milliliters of complete endothelial culture medium and gently rinse the cells off the culture dish. Centrifuge the cell suspension after collecting it in a 15 milliliter tube at 400G for 10 minutes. Re-suspend the cells in five milliliters of complete endothelial culture medium after removing the supernatant, then count the cells using a hemo-cytometer, and transfer a calculated volume of suspension containing 2 million cells to a sterile 1.5 milliliter tube.Pellet the cells by centrifuging the suspension at 400G for five minutes before removing the supernatant. The vascular cells are now ready for mixing with the matrix gel for matrix gel plug assay.

Préparation de cellules vasculaires pour un test in vivo de bouchon de gel matriciel

Preparing Matrix Gel with Vascular Cells for In Vivo Matrix Gel Plug Assay

To begin, prepare 10 times M199 culture medium by dissolving M199 powder to 10 times concentration in 90 milliliters of deionized water, followed by the addition of 10 milliliters of FBS. Filter the solution through a 0.22 micron filter. The filtered medium can be stored at four degrees Celsius for up to two months.For preparing the matrix gel with vascular cells, use about 2 million vascular cells. Cool the sterile 1.5 milliliter tube containing the appropriately prepared cell pellet in an ice bath. Thaw the matrix gel completely in an ice bath without mixing or vortexing it.Similarly, cool the prepared 10 times M199 culture media along with the test reagent or drug of interest to four degrees Celsius. Next, maintaining a volume ratio of 8.8 to 1 to 0.2, combine the pre-cooled matrix gel with the pre-cooled 10 times M199 media containing 10%FBS, and the pre-cooled test reagent to produce the matrix gel mixture. Finally, re-suspend the pre-cooled cells in 400 microliters of the prepared matrix gel mixture by mixing gently to avoid forming bubbles.Keep the tube containing the cells in matrix gel on ice until the mice are ready for the matrix gel injection.

Préparation d’un gel matriciel avec des cellules vasculaires pour un test in vivo de bouchon de gel matriciel

Matrix Gel Mixture Injection into Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To begin, place the 30 gauge one milliliter insulin syringes in a four degrees Celsius refrigerator for cooling. Keep the freshly prepared matrix gel mix containing vascular cells on ice until the mouse is ready for the injection. Next, place the properly anesthetized mouse on the operating board in a prone position and secure its limbs onto the board using tape.Load a pre cooled insulin syringe with 300 microliters of the matrix gel mixture, avoiding the formation of bubbles. Disinfect the skin on the back of the mouse using 75%alcohol pads, then subcutaneously inject 300 microliters of the matrix gel mixture in the syringe into one side of the animal's back. Gently remove the needle from the injection site to prevent any leakage of the gel mixture.Ensure the formation of a small hump at the injection site. Position the mouse on a heating pad for two minutes to allow the matrix gel mixture to coagulate and form a plug. Repeat the demonstrated steps to create a plug on the other side of the mouse's back.Mark the edges of the hump using a marker pen. House the animal in a specific pathogen free experimental animal laboratory at 20 to 24 degrees with 12 hour light and 12 hour dark cycles for seven days.

Injection d’un mélange de gel matriciel chez la souris pour le dosage du bouchon de gel matriciel

Dextran-FITC Injection and Matrix Gel Plug Collection from Mouse for Matrix Gel Plug Assay

To inject the mouse with Dextran, FITC seven days post the matrix gel injection, RESUSPEND 0.5 milligrams of Dextran, FITC in 500 microliters of double distilled water. Thoroughly vortex it to obtain a one microgram per microliter Dextran, FITC solution. Fill a 29 gauge syringe with 50 microliters of the Dextran FITC solution.Secure the mouse on the tail vein injection instrument, sanitize the tail with a 75%alcohol soaked cotton ball before carefully injecting 50 microliters of the Dextran FITC solution in the syringe into the tail vein. Apply pressure to the injection site with the cotton swab for one minute to staunch bleeding. Return the mouse to its cage and let it relax for 30 minutes before collecting the matrix gel plug.To collect the gel plug, cut the skin of the euthanized mouse along the marked border of the plug, using surgical scissors. And remove the skin above the matrix gel plug. Collect the plug and rinse it in a beaker with phosphate buffered saline to wash off any excess blood.Next, cover the bottom of the tissue embedding cassette with about 0.5 milliliters of tissue embedding gel. Then swiftly place the matrix gel plug on the tissue embedding gel in the planned orientation. Embed the plug with additional tissue embedding gel.Solidify the cassettes at minus 80 degrees Celsius for 12 hours. After removing the solidified plug block, cut 12 micron thick sections using a freezing microtome. Then mount the sections onto microscope slides.