Name: מחבר זרקור: קידום הנדסת רקמות גידים עם מודלים אורגנואידים תלת ממדיים
Uploaded: 2024-06-21T13:00:00
Description: Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

ד.ד. וש.מ.-ד. הכירו במענק BMBF "CellWiTaL: מערכות תאים ניתנות לשכפול למחקר תרופתי - הדפסת לייזר ללא שכבת העברה של תאים בודדים ספציפיים מאוד במבנים תאיים תלת ממדיים" הצעה מס' 13N15874. D.D. ו- V.R.A. מכירים במענק EU MSCA-COFUND OSTASKILLS "הכשרה הוליסטית של מחקרי אוסטאוארתריטיס מהדור הבא", GA Nr. 101034412. כל המחברים מודים לגברת ביאטה גייר על הסיוע הטכני.

הערה: כל השלבים חייבים להתבצע באמצעות טכניקות אספטיות.
1. תרבות וטרום התרחבות של NHDFs
<ol><li>הפשירו במהירות את בקבוקון ההקפאה המכיל פיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים (NHDFs, 1 x 106 תאים) בטמפרטורה של 37°C עד שהם כמעט מפשירים.</li>
	<li>יש להוסיף באיטיות 1 מ"ל של מדיום גידול פ...

מודל אורגנואיד תלת שלבי למחקר והנדסה של גידים

<ol>
	<li>Schneider, M., Angele, P., J&#228;rvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+plan+for+Achilles:+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing.">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li><li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+tendon+pathologies:+Triggers,+trails+and+end-state.">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).</li><li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy.">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li><li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments.">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li><li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendon+microenvironment:+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk.">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).</li><li>Docheva, D., M&#252;ller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologics+for+tendon+repair.">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li><li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model.">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).</li><li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model.">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li><li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+tendon+stem/progenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits.">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).</li><li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li><li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly.">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li><li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep.">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li><li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered,+scaffold-free+tendon+fibers.">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem/progenitor+cells+for+tendon+repair.">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).</li><li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+tendons:+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts.">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047 (2020).</li><li>Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+cell-based+therapies+for+tendon+repair.">Progress in cell-based therapies for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-&#946;+and+elongated+cell+shape.">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-&#946; and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li><li>Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., D&#252;nker, N., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+maintenance+of+tendon+progenitors+by+TGFbeta+signaling+are+essential+for+tendon+formation.">Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation.</a> Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).</li><li>Pattappa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physioxia+has+a+beneficial+effect+on+cartilage+matrix+production+in+interleukin-1+beta-inhibited+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis.">Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Cells. 8 (8), 936 (2019).</li><li>Shafiee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+physiologically+relevant+skin+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Small. 2304879, (2023).</li><li>Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+dish+makes+a+difference:+quantitative+comparison+of+polystyrene+culture+surfaces.">Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces.</a> Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).</li><li>Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+mechanics+of+thin+and+thick+composite+T-joints+reinforced+with+z-pins.">Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins.</a> Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).</li><li>Gelberman, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+ASCs+and+BMP-12+promotes+an+M2+macrophage+phenotype+and+enhances+tendon+healing.">Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing.</a> Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li></ol>

התוצאות שהודגמו במחקר זה מספקות תובנות חשובות לגבי ביסוס ואפיון מודל האורגנואיד התלת-ממדי NHDF לחקר רקמות T/L. פרוטוקול 3 השלבים הוביל להיווצרות אורגנואידים דמויי מוט תלת-ממדי המציגים תכונות אופייניות של נישת T/L. מודל זה דווח בעבר ב- Kroner-Weigl et al. 20237 והודגם בפירוט רב כאן.
<p clas...

גידים ורצועות (T/L) הם מרכיבים חיוניים של מערכת השלד והשרירים המספקים תמיכה חיונית ויציבות לגוף. למרות תפקידן הקריטי, רקמות חיבור אלה מועדות להתנוונות ולפציעות, הגורמות לכאב ולפגיעה בניידות1. יתר על כן, אספקת הדם המוגבלת שלהם ויכולת הריפוי האיטית שלהם עלולים להוביל לפציעות כרוניות, בעוד שגורמים כגון הזדקנות, תנועה חוזרת ונשנית ושיקום לא תקין מגבירים עוד יותר את הסיכון לניוון ופציעה2. טיפולים קונבנציונליים, כגון מנוחה, פיזיותרפיה והתערבויות כירורגיות, אינם מסוגלים לשחזר באופן מלא את המבנה והתפקוד של T/L. במהלך השנים האחרונות, חוקרים שאפו להבין טוב יותר את האופי המורכב של T / L על מנת לחפש טיפולים יעילים להפרעות T / L 3,4,5. T/L נבדלים על ידי מבנה מאורגן היררכית, מטריצה חוץ-תאית (ECM), המורכב בעיקר מסיבי קולגן מסוג I ופרוטאוגליקנים, תכונה שקשה לשכפל במבחנה6. מודלים מסורתיים של תרביות תאים דו-ממדיות (2D) אינם מצליחים ללכוד את הארגון התלת-ממדי (3D) האופייני של רקמות T/L, ומגבילים את פוטנציאל התרגום שלהם, כמו גם מעכבים את ההתקדמות החדשנית בתחום התחדשות T/L.
לאחרונה, הפיתוח של מודלים אורגנואידים תלת-ממדיים הציע אפשרויות חדשות לקידום מחקר בסיסי והנדסת רקמות ללא פיגומים של סוגי רקמות שונים 7,8,9,10,11,12,13. לדוגמה, כדי לחקור צומת מיוטנדי, Larkin et al. 2006 פיתחו מבני שרירי שלד תלת-ממדיים יחד עם מקטעי גידים מאורגנים עצמיים הנגזרים מגיד זנב חולדה10. יתר על כן, שילה ועמיתיו 2013, באמצעות שימוש בתעלות גידול מצופות פיברונקטין במיקרו-מכונה, כיוונו את ההרכבה העצמית של פיברובלסטים עוריים אנושיים ליצירת סיבים תאיים ללא סיוע של פיגומים תלת-ממדיים, גישה שיכולה ללכוד תכונות מפתח של התפתחות גידים עובריים11. במחקר שנערך על ידי Florida et al. 2016, תאי סטרומה ממח עצם הורחבו תחילה לשושלות עצם ורצועות, ולאחר מכן שימשו ליצירת יריעות תאים חד-שכבתיות בהרכבה עצמית, אשר יושמו לאחר מכן ליצירת מבנה רב-פאזי של עצם-רצועה-עצם המחקה את הרצועה הצולבת הקדמית הטבעית, מודל שמטרתו לשפר את ההבנה של התחדשות רצועות12. כדי להבהיר תהליכי מכנוטרנסדוקציה של גידים, Mubyana et al. 2018 השתמשו במתודולוגיה נטולת פיגומים שבאמצעותה נוצרו סיבי גיד בודדים ונתונים לפרוטוקול העמסה מכני13. אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים בעצמם המחקים את הארכיטקטורה המקורית, המיקרו-סביבה והפונקציונליות של רקמות. תרביות אורגנואידים תלת-ממדיות מספקות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר ביולוגיה של רקמות ואיברים, כמו גם פתופיזיולוגיה. מודלים כאלה יכולים לשמש גם כדי לגרום להתמיינות ספציפית לרקמות של סוגי תאי גזע / אב שונים14,15. לפיכך, יישום מודלים אורגנואידים תלת ממדיים בתחום הביולוגיה T/L והנדסת רקמות הופך לגישה אטרקטיבית מאוד 9,16. מקורות תאים חלופיים יכולים להיות מיושמים עבור הרכבת אורגנואידים ולעורר לקראת התמיינות טנוגנית. סוג תא רלוונטי אחד המשמש להדגמה במחקר זה הוא פיברובלסטים עוריים 7,17,18. תאים אלה נגישים בקלות באמצעות הליך ביופסיה של העור, שהוא פחות פולשני בהשוואה לניקוב מח עצם או שאיבת שומן וניתן להכפיל אותם די מהר למספרים גדולים בשל יכולת ההתרבות הטובה שלהם. לעומת זאת, סוגי תאים מיוחדים יותר, כגון פיברובלסטים תושבי T/L, מאתגרים יותר לבידוד והרחבה. לכן, פיברובלסטים עוריים שימשו גם כנקודת מוצא לטכנולוגיות תכנות מחדש של תאים לקראת תאי גזע עובריים פלוריפוטנטיים מושרים19. חשיפת פיברובלסטים עוריים לתנאי תרבית תלת-ממדיים ספציפיים ולרמזי איתות, כגון טרנספורמציה של גורם גדילה-בטא 3 (TGFß3), אשר דווח כי הוא פועל כמווסת מרכזי של תהליכים תאיים שונים, כולל היווצרות ותחזוקה של T/L, יכול להגביר את ההתמיינות הטנוגנית שלהם במבחנה המובילה לביטוי גנים ספציפיים לגידים ולשקיעת T/L-טיפוסי ECM20, 21.
כאן, אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול אורגנואיד תלת-שלבי שהוקם ויושם בעבר (הרחבה דו-ממדית, גירוי דו-ממדי והבשלה תלת-ממדית) תוך שימוש בפיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים בוגרים (NHDFs) הזמינים מסחרית כמקור תא, ומציע מודל רב ערך לחקר טנוגנזה במבחנה 7. למרות העובדה שמודל זה אינו שווה ערך לרקמת In vivo T/L, הוא עדיין מספק מערכת רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית שניתן להשתמש בה לחקר מנגנוני התמיינות תאית, חיקוי פתופיזיולוגיה של T/L במבחנה, והקמת פלטפורמות לרפואה מותאמת אישית וסינון תרופות. יתר על כן, בעתיד, מחקרים יכולים להעריך אם אורגנואידים תלת-ממדיים מתאימים להנדסת T/L נטולת פיגומים על ידי אופטימיזציה נוספת, כמו גם ניתנים לשימוש לפיתוח מבנים חזקים מבחינה מכנית בקנה מידה הדומים מאוד לממדים ולתכונות המבניות והביופיזיות של רקמות T/L מקוריות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;&#160;</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm adherent cell culture dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm non-adherent petri dish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-medium</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands&#160;&#160;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold standard&#160;</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose&#160;</td>
			<td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose medium&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>DMEM-HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>DMEM-LPXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>&#160;Anprotec, Bruckberg, Germany&#160;</td>
			<td>AC-SM-0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>C-23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope with high resolution camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Zeiss Axio Observer with&#160; Axiocam 506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>NEAA-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal pins&#160;</td>
			<td>EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic&#160;</td>
			<td>04.31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td>&#160;PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td>C-12302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>&#160;AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;3&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems, Wiesbaden, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;8420-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% DPBS&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;TRY-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of self-assembled cell sheet culture and manual generation of a 3d tendon/ligament-like organoid by using human dermal fibroblasts

גידים ורצועות (T/L) הם מבנים חזקים המאורגנים היררכית המאחדים את מערכת השלד והשרירים. לרקמות אלה יש מטריצה חוץ-תאית עשירה בקולגן מסוג I (ECM) ותאי שושלת T/L המסודרים בקפידה הממוקמים בעיקר בשורות מקבילות. לאחר פציעה, T/L דורשים זמן רב לשיקום עם סיכון גבוה לכישלון ולעתים קרובות תוצאות תיקון לא משביעות רצון. למרות ההתקדמות האחרונה במחקר הביולוגיה של T/L, אחד האתגרים שנותרו הוא שבתחום T/L עדיין חסר פרוטוקול התמיינות סטנדרטי המסוגל לשחזר את תהליך היווצרות T/L במבחנה. לדוגמה, התמיינות עצם ושומן של תאים מקדימים מזנכימליים דורשת רק תרבית תאים דו-ממדית סטנדרטית (2D) ותוספת של אמצעי גירוי ספציפיים. לצורך התמיינות לסחוס, יש צורך בתרבית כדוריות תלת מימדית (תלת מימדית) ותוספת של TGFß. עם זאת, התמיינות תאים לגיד דורשת מודל תרבית תלת ממדי מסודר מאוד, אשר באופן אידיאלי צריך להיות נתון גם לגירוי מכני דינמי. הקמנו מודל אורגנואיד בן 3 שלבים (הרחבה, גירוי והתבגרות) כדי ליצור מבנה דמוי מוט תלת-ממדי מתוך יריעת תאים בהרכבה עצמית, המספקת מיקרו-סביבה טבעית עם גורמי ECM, אוטוקרינים ופרקריניים משלה. לאורגנואידים דמויי מוטות אלה יש ארכיטקטורה תאית רב-שכבתית בתוך ECM עשיר וניתן לטפל בהם די בקלות לחשיפה למתח מכני סטטי. כאן, הדגמנו את פרוטוקול 3 השלבים באמצעות פיברובלסטים עוריים הזמינים באופן מסחרי. אנו יכולים להראות שסוג התא הזה יוצר אורגנואידים חזקים ושופעי ECM. ההליך המתואר יכול להיות ממוטב עוד יותר במונחים של מדיה תרבותית ואופטימיזציה לקראת גירוי מכני צירי דינמי. באותו אופן, מקורות תאים חלופיים יכולים להיבדק עבור הפוטנציאל שלהם ליצור אורגנואידים T / L ובכך לעבור התמיינות T / L. לסיכום, הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי של גידים ואפילו להנדסת T/L ללא פיגומים.

Tendons and ligaments (T/L) are vital components of the musculoskeletal system that provide essential support and stability to the body. Despite their critical role, these connective tissues are prone to degeneration and injury, causing pain and impairment of mobility1. Moreover, their limited blood supply and slow healing capacity can lead to chronic injuries, whereas factors such as aging, repetitive motion, and improper rehabilitation further increase the risk of degeneration and injury2. Conventional treatments, such as rest, physical therapy, and surgical interventions, are unable to fully restore the T/L structure and function. Over the past few years, researchers have strived to better understand the intricate nature of T/L in order to seek effective treatments for T/L disorders3,4,5. T/L are distinguished by a hierarchically organized, extracellular matrix (ECM)-dominated structure, composed primarily of type I collagen fibers and proteoglycans, a feature that is difficult to be replicated in vitro6. Traditional two-dimensional (2D) cell culture models fail to capture the characteristic three-dimensional (3D) organization of T/L tissues, limiting their translational potential as well as hindering the innovative progress in the field of T/L regeneration.
Recently, the development of 3D organoid models has offered new possibilities for advancing basic research and scaffolds-free tissue engineering of various tissue types7,8,9,10,11,12,13. For example, to investigate myotendinous junction, Larkin et al. 2006 developed 3D skeletal muscle constructs together with self-organized tendon segments derived from rat tail tendon10. Moreover, Schiele et al. 2013, by using micromachined fibronectin-coated growth channels, directed the self-assembly of human dermal fibroblasts to form cellular fibers without the assistance of 3D scaffold, an approach that can capture key traits of embryonic tendon development11. In the study by Florida et al. 2016, bone marrow stromal cells were first expanded into bone and ligament lineages, next used to generate self-assembled monolayer cell sheets, which were then implemented to create a multiphasic bone-ligament-bone construct mimicking the native anterior cruciate ligament, a model aiming at improved understanding of ligament regeneration12. To elucidate tendon mechanotransduction processes, Mubyana et al. 2018 utilized a scaffold-free methodology by which single tendon fibers were created and subjected to mechanical loading protocol13. Organoids are self-organized 3D structures that mimic the native architecture, microenvironment, and functionality of tissues. 3D organoid cultures provide a more physiologically relevant model for studying tissue and organ biology as well as pathophysiology. Such models can also be used to induce tissue-specific differentiation of different stem/progenitor cell types14,15. Hence, implementing 3D organoid models in the field of T/L biology and tissue engineering becomes a very attractive approach9,16. Alternative cell sources can be implemented for the organoid assembly and stimulated toward tenogenic differentiation. One relevant cell type used for demonstration in this study is dermal fibroblasts7,17,18. These cells are easily accessible through a skin biopsy procedure, which is less invasive compared to bone marrow puncture or liposuction and can be multiplied fairly quickly to large numbers due to their good proliferative capacity. In contrast, more specialized cell types, such as T/L-resident fibroblasts, are more challenging to isolate and expand. Therefore, dermal fibroblasts were also used as a starting point for cell reprogramming technologies towards induced pluripotent embryonic stem cells19. Subjecting dermal fibroblasts to specific 3D culture conditions and signaling cues, such as transforming growth factor-beta 3 (TGF&#223;3), which has been reported to act as a key regulator of various cellular processes, including the formation and maintenance of T/L, can potentiate their in vitro tenogenic differentiation leading to the expression of tendon-specific genes and the deposition of T/L-typical ECM20,21.
Here, we describe and demonstrate a previously established and implemented 3-step (2D expansion, 2D stimulation, and 3D maturation) organoid protocol using commercially available normal adult human dermal fibroblasts (NHDFs) as a cell source, offering a valuable model for studying in vitro tenogenesis7. Despite the fact that this model is not equivalent to in vivo T/L tissue, it still provides a more physiologically relevant system that can be used for investigating cellular differentiation mechanisms, mimicking T/L pathophysiology in vitro, and establishing T/L personalized medicine and drug screening platforms. Moreover, in the future, studies can evaluate whether the 3D organoids are suitable for scaffold-free T/L engineering by further optimization as well as utilizable for the development of scaled-up mechanically robust constructs that closely resemble the dimensions and structural and biophysical properties of native T/L tissues.

מחבר זרקור: קידום הנדסת רקמות גידים עם מודלים אורגנואידים תלת ממדיים

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

We demonstrate a previous established and implement three-step organoid protocol using commercially available, normal human dermal fibroblasts as a cell source. The 3D organoid model holds several advantage for tissue engineering and regenerative medicine application. It mimics closely the cellular composition and organization as well as cell-to-cell and cell-to-matrix interactions of tendon tissues.The established 3D tendon-ligament organoid approach can be used as a model for tendon basic and applied research in the following areas. In vitro tenogenesis, disease mechanism, drug testing, and scaffold-free tendon tissue engineering.

מודל האורגנואידים התלת-ממדיים T/L הוקם בעבר והודגם כאן על ידי יישום NHDF שנרכש מסחרית (n = 3, 3 אורגנואידים לכל תורם, NHDF שימשו במעברים 5-8). זרימת העבודה של המודל מסוכמת באיור 1. איור 2 מראה תמונות מייצגות של ניגודיות פאזה של תרבית NHDF במהלך טרום ההתפשטות בצלוחיות T-75 (<s...

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

אנו מדגימים פרוטוקול אורגנואיד בן שלושה שלבים שהוקם ומיישמים פרוטוקול אורגנואיד תלת-שלבי תוך שימוש בפיברובלסטים עוריים אנושיים רגילים הזמינים מסחרית כמקור תא. מודל האורגנואיד התלת-ממדי טומן בחובו מספר יתרונות להנדסת רקמות וליישום רפואה רגנרטיבית. הוא מחקה מקרוב את ההרכב והארגון של התא, כמו גם אינטראקציות בין תאים ותא למטריצה של רקמות גידים.הגישה האורגנואידית התלת-ממדית המבוססת על רצועות-גידים, יכולה לשמש כמודל למחקר בסיסי ויישומי של הגידים בתחומים הבאים. טנוגנזה במבחנה, מנגנון מחלה, בדיקות תרופות והנדסת רקמות גידים ללא פיגומים.

demonstration-self-assembled-cell-sheet-culture-manual-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.