Name: लेखक स्पॉटलाइट: 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल के साथ टेंडन टिशू इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाना
Uploaded: 2024-06-21T13:00:00
Description: Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

डी.डी. और एस.एम.-डी. BMBF ग्रांट को स्वीकार करें "CellWiTaL: ड्रग रिसर्च के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल सिस्टम - त्रि-आयामी सेलुलर संरचनाओं में अत्यधिक विशिष्ट एकल कोशिकाओं की परत-मुक्त लेजर प्रिंटिंग को स्थानांतरित करें" प्रस्ताव Nr. 13N15874। डीडी और वीआरए यूरोपीय संघ एमएससीए-सीओफंड ग्रांट ओएसटीएस्किल्स को स्वीकार करते हैं, "अगली पीढ़ी के ऑस्टियोआर्थराइटिस शोधों का समग्र प्रशिक्षण," जीए, एनआर 101034412। सभी लेखक तकनीकी सहायता के लिए श्रीमती बीट गेयर को स्वीकार करते हैं।

नोट: सभी चरणों को सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करके आयोजित किया जाना चाहिए।
1. एनएचडीएफ की संस्कृति और पूर्व-विस्तार
<ol><li>तेजी से क्रायो-शीशी युक्त वयस्क क्रायोप्रेज़र्व्ड सामान्य ?...

कण्डरा अनुसंधान और इंजीनियरिंग के लिए तीन-चरण ऑर्गेनॉइड मॉडल

<ol>
	<li>Schneider, M., Angele, P., J&#228;rvinen, T. A. H., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+plan+for+Achilles:+Therapeutics+steering+the+fate+and+functions+of+stem+cells+in+tendon+wound+healing.">Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing.</a> Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).</li><li>Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+tendon+pathologies:+Triggers,+trails+and+end-state.">Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).</li><li>Snedeker, J. G., Foolen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendon+injury+and+repair+-+A+perspective+on+the+basic+mechanisms+of+tendon+disease+and+future+clinical+therapy.">Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy.</a> Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).</li><li>Lomas, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+in+scaffold-based+tendon+treatments.">The past, present and future in scaffold-based tendon treatments.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).</li><li>Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tendon+microenvironment:+Engineered+in+vitro+models+to+study+cellular+crosstalk.">The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk.</a> Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).</li><li>Docheva, D., M&#252;ller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologics+for+tendon+repair.">Biologics for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).</li><li>Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+Is+not+sufficient+to+facilitate+tenogenic+differentiation+of+dermal+fibroblasts+in+a+3D+organoid+model.">Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model.</a> Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).</li><li>Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+follicle+cell+differentiation+towards+periodontal+ligament-like+tissue+in+a+self-assembly+three-dimensional+organoid+model.">Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model.</a> Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).</li><li>Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aged+tendon+stem/progenitor+cells+are+less+competent+to+form+3D+tendon+organoids+due+to+cell+autonomous+and+matrix+production+deficits.">Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).</li><li>Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functional+evaluation+of+tendon-skeletal+muscle+constructs+engineered+in+vitro.">Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro.</a> Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).</li><li>Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+cellular+fibers+for+musculoskeletal+soft+tissues+using+directed+self-assembly.">Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly.</a> Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).</li><li>Florida, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+structural+and+cellular+remodeling+of+engineered+bone-ligament-bone+constructs+used+for+anterior+cruciate+ligament+reconstruction+in+sheep.">In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep.</a> Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).</li><li>Mubyana, K., Corr, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+uniaxial+tensile+strain+enhances+the+mechanical+properties+of+engineered,+scaffold-free+tendon+fibers.">Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers.</a> Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).</li><li>Brassard, J. A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cell+self-organization+to+build+better+organoids.">Engineering stem cell self-organization to build better organoids.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Hsieh, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparison+of+2D-cell+culture+and+3D-cell+sheets+of+scleraxis-programmed+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+to+primary+tendon+stem/progenitor+cells+for+tendon+repair.">In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair.</a> Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).</li><li>Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebuilding+tendons:+A+concise+review+on+the+potential+of+dermal+fibroblasts.">Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts.</a> Cells. 9 (9), 2047 (2020).</li><li>Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+cell-based+therapies+for+tendon+repair.">Progress in cell-based therapies for tendon repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).</li><li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming.">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+predominant+tenogenic+phenotype+in+human+dermal+fibroblasts+via+synergistic+effect+of+TGF-&#946;+and+elongated+cell+shape.">Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-&#946; and elongated cell shape.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).</li><li>Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., D&#252;nker, N., Schweitzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+and+maintenance+of+tendon+progenitors+by+TGFbeta+signaling+are+essential+for+tendon+formation.">Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation.</a> Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).</li><li>Pattappa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physioxia+has+a+beneficial+effect+on+cartilage+matrix+production+in+interleukin-1+beta-inhibited+mesenchymal+stem+cell+chondrogenesis.">Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis.</a> Cells. 8 (8), 936 (2019).</li><li>Shafiee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+physiologically+relevant+skin+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Small. 2304879, (2023).</li><li>Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+dish+makes+a+difference:+quantitative+comparison+of+polystyrene+culture+surfaces.">Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces.</a> Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).</li><li>Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strengthening+mechanics+of+thin+and+thick+composite+T-joints+reinforced+with+z-pins.">Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins.</a> Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).</li><li>Gelberman, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+administration+of+ASCs+and+BMP-12+promotes+an+M2+macrophage+phenotype+and+enhances+tendon+healing.">Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing.</a> Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).</li><li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+organoids.">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li><li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening.">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li><li>Yan, H. H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+human+gastric+cancer+organoid+biobank+captures+tumor+subtype+heterogeneity+and+enables+therapeutic+screening.">A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).</li></ol>

इस अध्ययन में प्रदर्शित परिणाम टी/एल ऊतकों के अध्ययन के लिए एनएचडीएफ 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल की स्थापना और लक्षण वर्णन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। 3-चरण प्रोटोकॉल ने 3 डी रॉड जैसे ऑर्गेनोइड के...

टेंडन और लिगामेंट्स (टी/एल) मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम के महत्वपूर्ण घटक हैं जो शरीर को आवश्यक सहायता और स्थिरता प्रदान करते हैं। उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद, इन संयोजी ऊतकों को अध: पतन और चोट लगने का खतरा होता है, जिससे दर्द और गतिशीलता की हानिहोती है। इसके अलावा, उनकी सीमित रक्त आपूर्ति और धीमी गति से उपचार क्षमता पुरानी चोटों को जन्म दे सकती है, जबकि उम्र बढ़ने, दोहराव की गति और अनुचित पुनर्वास जैसे कारक अध: पतन और चोट के जोखिम को और बढ़ातेहैं। पारंपरिक उपचार, जैसे आराम, भौतिक चिकित्सा और सर्जिकल हस्तक्षेप, टी / एल संरचना और कार्य को पूरी तरह से बहाल करने में असमर्थ हैं। पिछले कुछ वर्षों में, शोधकर्ताओं ने टी/एल विकारों 3,4,5के लिए प्रभावी उपचार की तलाश करने के लिए टी/एल की जटिल प्रकृति को बेहतर ढंग से समझने का प्रयास किया है। टी / एल एक पदानुक्रमित रूप से संगठित, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) -वर्चस्व वाली संरचना द्वारा प्रतिष्ठित हैं, जो मुख्य रूप से टाइप I कोलेजन फाइबर और प्रोटीओग्लाइकेन्स से बना है, एक ऐसी विशेषता जिसे इन विट्रो6 में दोहराया जाना मुश्किल है। पारंपरिक द्वि-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति मॉडल टी / एल ऊतकों की विशेषता त्रि-आयामी (3 डी) संगठन को पकड़ने में विफल रहते हैं, उनकी अनुवाद क्षमता को सीमित करने के साथ-साथ टी / एल उत्थान के क्षेत्र में अभिनव प्रगति में बाधा डालते हैं।
हाल ही में, 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल के विकास ने 7,8,9,10,11,12,13 प्रकार के बुनियादी अनुसंधान और मचान मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाने के लिए नई संभावनाओं की पेशकश की है। उदाहरण के लिए, मायोटेंडिनस जंक्शन की जांच करने के लिए, लार्किन एट अल 2006 ने चूहे की पूंछकण्डरा 10 से प्राप्त स्व-संगठित कण्डरा खंडों के साथ मिलकर 3 डी कंकाल की मांसपेशी का निर्माण विकसित किया। इसके अलावा, Schiele एट अल 2013, micromachined फाइब्रोनेक्टिन लेपित विकास चैनलों का उपयोग करके, 3 डी मचान की सहायता के बिना सेलुलर फाइबर बनाने के लिए मानव त्वचीय fibroblasts की आत्म विधानसभा निर्देशित, एक दृष्टिकोण है कि भ्रूण कण्डरा विकास11 के प्रमुख लक्षण पकड़ सकते हैं. फ्लोरिडा एट अल 2016 द्वारा अध्ययन में, अस्थि मज्जा स्ट्रोमल कोशिकाओं को पहले हड्डी और लिगामेंट वंशावली में विस्तारित किया गया था, अगले स्व-इकट्ठे मोनोलेयर सेल शीट उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता था, जिसे तब देशी पूर्वकाल क्रूसिएट लिगामेंट की नकल करते हुए एक मल्टीफैसिक हड्डी-लिगामेंट-हड्डी निर्माण बनाने के लिए लागू किया गया था, एक मॉडल जिसका लक्ष्य लिगामेंट पुनर्जनन12 की बेहतर समझ है. कण्डरा मेकेनोट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए, मुब्याना एट अल 2018 ने एक मचान मुक्त पद्धति का उपयोग किया जिसके द्वारा एकल कण्डरा फाइबर बनाए गए और यांत्रिक लोडिंग प्रोटोकॉल13 के अधीन थे। ऑर्गेनोइड स्व-संगठित 3 डी संरचनाएं हैं जो मूल वास्तुकला, माइक्रोएन्वायरमेंट और ऊतकों की कार्यक्षमता की नकल करती हैं। 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियां ऊतक और अंग जीव विज्ञान के साथ-साथ पैथोफिज़ियोलॉजी के अध्ययन के लिए एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करती हैं। इस तरह के मॉडल भी विभिन्न स्टेम / पूर्वज सेल प्रकार14,15 के ऊतक विशिष्ट भेदभाव प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, टी/एल जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल को लागू करना एक बहुत ही आकर्षक दृष्टिकोण 9,16 बन जाता है। वैकल्पिक सेल स्रोतों को ऑर्गेनॉइड असेंबली के लिए लागू किया जा सकता है और टेनोजेनिक भेदभाव की ओर प्रेरित किया जा सकता है। इस अध्ययन में प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया एक प्रासंगिक सेल प्रकार त्वचीय fibroblasts 7,17,18 है. ये कोशिकाएं त्वचा बायोप्सी प्रक्रिया के माध्यम से आसानी से सुलभ होती हैं, जो अस्थि मज्जा पंचर या लिपोसक्शन की तुलना में कम आक्रामक होती है और उनकी अच्छी प्रोलिफेरेटिव क्षमता के कारण बड़ी संख्या में काफी जल्दी गुणा किया जा सकता है। इसके विपरीत, अधिक विशिष्ट सेल प्रकार, जैसे कि टी/एल-निवासी फाइब्रोब्लास्ट्स, को अलग करना और विस्तार करना अधिक चुनौतीपूर्ण होता है। इसलिए, त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स भी प्रेरित प्लुरिपोटेंट भ्रूण स्टेम कोशिकाओं19 की ओर सेल रिप्रोग्रामिंग प्रौद्योगिकियों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया. विशिष्ट 3 डी संस्कृति की स्थिति और सिग्नलिंग संकेतों के लिए त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के अधीन, जैसे कि विकास कारक-बीटा 3 (टीजीएफ ß 3) को बदलना, जिसे विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं के प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करने के लिए सूचित किया गया है, जिसमें गठन और रखरखाव शामिल है टी/एल, उनके इन विट्रो टेनोजेनिक भेदभाव को शक्तिशाली बना सकता है जिससे कण्डरा-विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति और टी/एल-विशिष्ट ईसीएम20 का जमाव होता है, 21.
यहां, हम सेल स्रोत के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सामान्य वयस्क मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स (एनएचडीएफ) का उपयोग करके पहले से स्थापित और कार्यान्वित 3-चरण (2 डी विस्तार, 2 डी उत्तेजना, और 3 डी परिपक्वता) ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल का वर्णन और प्रदर्शन करते हैं, जो अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल पेश करता है इन विट्रो टेनोजेनेसिस7. इस तथ्य के बावजूद कि यह मॉडल विवो टी / एल ऊतक के बराबर नहीं है, यह अभी भी एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रणाली प्रदान करता है जिसका उपयोग सेलुलर भेदभाव तंत्र की जांच करने, इन विट्रो में टी / एल पैथोफिज़ियोलॉजी की नकल करने और टी / एल व्यक्तिगत दवा और दवा स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों की स्थापना के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, भविष्य में, अध्ययन यह मूल्यांकन कर सकते हैं कि क्या 3 डी ऑर्गेनोइड मचान मुक्त टी / एल इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त हैं और साथ ही स्केल-अप यांत्रिक रूप से मजबूत निर्माणों के विकास के लिए उपयोग करने योग्य हैं जो देशी टी / एल ऊतकों के आयामों और संरचनात्मक और बायोफिजिकल गुणों से निकटता से मिलते जुलते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;&#160;</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm adherent cell culture dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm non-adherent petri dish&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany&#160;</td>
			<td>CLS430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-medium</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands&#160;&#160;</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold standard&#160;</td>
			<td>Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands</td>
			<td>4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Sucrose&#160;</td>
			<td>AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td>A2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose medium&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>DMEM-HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>DMEM-LPXA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>&#160;Anprotec, Bruckberg, Germany&#160;</td>
			<td>AC-SM-0027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth medium 2&#160;</td>
			<td>PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>C-23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope with high resolution camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>NA</td>
			<td>Zeiss Axio Observer with&#160; Axiocam 506</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM amino acids&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;&#160;</td>
			<td>NEAA-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal pins&#160;</td>
			<td>EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic&#160;</td>
			<td>04.31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal human dermal fibroblasts&#160;</td>
			<td>&#160;PromoCell, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td>C-12302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>&#160;AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>A3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF&#223;3&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems, Wiesbaden, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;8420-B3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0,05% DPBS&#160;</td>
			<td>Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany&#160;</td>
			<td>&#160;TRY-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demonstration of self-assembled cell sheet culture and manual generation of a 3d tendon/ligament-like organoid by using human dermal fibroblasts

टेंडन और लिगामेंट्स (टी/एल) मजबूत पदानुक्रमित रूप से संगठित संरचनाएं हैं जो मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम को एकजुट करती हैं। इन ऊतकों में एक कड़ाई से व्यवस्थित कोलेजन प्रकार I-समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (ECM) और T/L-वंश कोशिकाएं होती हैं जो मुख्य रूप से समानांतर पंक्तियों में स्थित होती हैं। चोट के बाद, टी / एल को उच्च विफलता जोखिम और अक्सर असंतोषजनक मरम्मत परिणामों के साथ पुनर्वास के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। टी / एल जीव विज्ञान अनुसंधान में हाल की प्रगति के बावजूद, शेष चुनौतियों में से एक यह है कि टी / एल क्षेत्र में अभी भी एक मानकीकृत भेदभाव प्रोटोकॉल का अभाव है जो इन विट्रो में टी / एल गठन प्रक्रिया को पुनरावृत्ति करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, मेसेनकाइमल अग्रदूत कोशिकाओं की हड्डी और वसा भेदभाव के लिए केवल मानक दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति और विशिष्ट उत्तेजना मीडिया के अतिरिक्त की आवश्यकता होती है। उपास्थि के भेदभाव के लिए, तीन आयामी (3 डी) गोली संस्कृति और टीजीएफ के पूरक आवश्यक है। हालांकि, कण्डरा के लिए सेल भेदभाव को एक बहुत ही व्यवस्थित 3 डी संस्कृति मॉडल की आवश्यकता होती है, जो आदर्श रूप से गतिशील यांत्रिक उत्तेजना के अधीन भी होना चाहिए। हमने एक स्व-इकट्ठे सेल शीट से 3 डी रॉड जैसी संरचना बनाने के लिए एक 3-चरण (विस्तार, उत्तेजना और परिपक्वता) ऑर्गेनॉइड मॉडल स्थापित किया है, जो अपने स्वयं के ईसीएम, ऑटोक्राइन और पैराक्राइन कारकों के साथ एक प्राकृतिक माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदान करता है। इन रॉड जैसे ऑर्गेनोइड में समृद्ध ईसीएम के भीतर एक बहुस्तरीय सेलुलर आर्किटेक्चर होता है और स्थैतिक यांत्रिक तनाव के संपर्क में आने के लिए इसे आसानी से संभाला जा सकता है। यहां, हमने व्यावसायिक रूप से उपलब्ध त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके 3-चरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया। हम दिखा सकते हैं कि यह सेल प्रकार मजबूत और ईसीएम-प्रचुर मात्रा में ऑर्गेनोइड बनाता है। वर्णित प्रक्रिया को संस्कृति मीडिया के संदर्भ में आगे अनुकूलित किया जा सकता है और गतिशील अक्षीय यांत्रिक उत्तेजना की ओर अनुकूलित किया जा सकता है। उसी तरह, वैकल्पिक सेल स्रोतों को टी/एल ऑर्गेनोइड बनाने की उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया जा सकता है और इस प्रकार टी/एल भेदभाव से गुजरना पड़ता है। संक्षेप में, स्थापित 3 डी टी / एल ऑर्गेनॉइड दृष्टिकोण का उपयोग कण्डरा बुनियादी अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में और यहां तक कि मचान मुक्त टी / एल इंजीनियरिंग के लिए भी किया जा सकता है।

Tendons and ligaments (T/L) are vital components of the musculoskeletal system that provide essential support and stability to the body. Despite their critical role, these connective tissues are prone to degeneration and injury, causing pain and impairment of mobility1. Moreover, their limited blood supply and slow healing capacity can lead to chronic injuries, whereas factors such as aging, repetitive motion, and improper rehabilitation further increase the risk of degeneration and injury2. Conventional treatments, such as rest, physical therapy, and surgical interventions, are unable to fully restore the T/L structure and function. Over the past few years, researchers have strived to better understand the intricate nature of T/L in order to seek effective treatments for T/L disorders3,4,5. T/L are distinguished by a hierarchically organized, extracellular matrix (ECM)-dominated structure, composed primarily of type I collagen fibers and proteoglycans, a feature that is difficult to be replicated in vitro6. Traditional two-dimensional (2D) cell culture models fail to capture the characteristic three-dimensional (3D) organization of T/L tissues, limiting their translational potential as well as hindering the innovative progress in the field of T/L regeneration.
Recently, the development of 3D organoid models has offered new possibilities for advancing basic research and scaffolds-free tissue engineering of various tissue types7,8,9,10,11,12,13. For example, to investigate myotendinous junction, Larkin et al. 2006 developed 3D skeletal muscle constructs together with self-organized tendon segments derived from rat tail tendon10. Moreover, Schiele et al. 2013, by using micromachined fibronectin-coated growth channels, directed the self-assembly of human dermal fibroblasts to form cellular fibers without the assistance of 3D scaffold, an approach that can capture key traits of embryonic tendon development11. In the study by Florida et al. 2016, bone marrow stromal cells were first expanded into bone and ligament lineages, next used to generate self-assembled monolayer cell sheets, which were then implemented to create a multiphasic bone-ligament-bone construct mimicking the native anterior cruciate ligament, a model aiming at improved understanding of ligament regeneration12. To elucidate tendon mechanotransduction processes, Mubyana et al. 2018 utilized a scaffold-free methodology by which single tendon fibers were created and subjected to mechanical loading protocol13. Organoids are self-organized 3D structures that mimic the native architecture, microenvironment, and functionality of tissues. 3D organoid cultures provide a more physiologically relevant model for studying tissue and organ biology as well as pathophysiology. Such models can also be used to induce tissue-specific differentiation of different stem/progenitor cell types14,15. Hence, implementing 3D organoid models in the field of T/L biology and tissue engineering becomes a very attractive approach9,16. Alternative cell sources can be implemented for the organoid assembly and stimulated toward tenogenic differentiation. One relevant cell type used for demonstration in this study is dermal fibroblasts7,17,18. These cells are easily accessible through a skin biopsy procedure, which is less invasive compared to bone marrow puncture or liposuction and can be multiplied fairly quickly to large numbers due to their good proliferative capacity. In contrast, more specialized cell types, such as T/L-resident fibroblasts, are more challenging to isolate and expand. Therefore, dermal fibroblasts were also used as a starting point for cell reprogramming technologies towards induced pluripotent embryonic stem cells19. Subjecting dermal fibroblasts to specific 3D culture conditions and signaling cues, such as transforming growth factor-beta 3 (TGF&#223;3), which has been reported to act as a key regulator of various cellular processes, including the formation and maintenance of T/L, can potentiate their in vitro tenogenic differentiation leading to the expression of tendon-specific genes and the deposition of T/L-typical ECM20,21.
Here, we describe and demonstrate a previously established and implemented 3-step (2D expansion, 2D stimulation, and 3D maturation) organoid protocol using commercially available normal adult human dermal fibroblasts (NHDFs) as a cell source, offering a valuable model for studying in vitro tenogenesis7. Despite the fact that this model is not equivalent to in vivo T/L tissue, it still provides a more physiologically relevant system that can be used for investigating cellular differentiation mechanisms, mimicking T/L pathophysiology in vitro, and establishing T/L personalized medicine and drug screening platforms. Moreover, in the future, studies can evaluate whether the 3D organoids are suitable for scaffold-free T/L engineering by further optimization as well as utilizable for the development of scaled-up mechanically robust constructs that closely resemble the dimensions and structural and biophysical properties of native T/L tissues.

लेखक स्पॉटलाइट: 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल के साथ टेंडन टिशू इंजीनियरिंग को आगे बढ़ाना

मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके स्व-इकट्ठे सेल शीट संस्कृति और 3 डी कण्डरा / स्नायुबंधन जैसे अंग के मैनुअल जनरेशन का प्रदर्शन

We demonstrate a previous established and implement three-step organoid protocol using commercially available, normal human dermal fibroblasts as a cell source. The 3D organoid model holds several advantage for tissue engineering and regenerative medicine application. It mimics closely the cellular composition and organization as well as cell-to-cell and cell-to-matrix interactions of tendon tissues.The established 3D tendon-ligament organoid approach can be used as a model for tendon basic and applied research in the following areas. In vitro tenogenesis, disease mechanism, drug testing, and scaffold-free tendon tissue engineering.

3 डी टी / एल ऑर्गेनॉइड मॉडल पहले व्यावसायिक रूप से खरीदे गए एनएचडीएफ (एन = 3, दाता प्रति 3 ऑर्गेनोइड्स, एनएचडीएफ 5-8 मार्ग पर उपयोग किए गए थे) को लागू करके यहां स्थापित और प्रदर्शित किया गया था। मॉडल कार्यप्रवा...

इसमें, हम एक तीन-चरण ऑर्गेनॉइड मॉडल (दो-आयामी [2 डी] विस्तार, 2 डी उत्तेजना, तीन आयामी [3 डी] परिपक्वता) का प्रदर्शन करते हैं जो कण्डरा मौलिक अनुसंधान के लिए एक आशाजनक उपकरण और कण्डरा ऊतक इंजीनियरिंग के लिए एक संभावित मचान मुक्त विधि प्रदान करता है।

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly ...

हम सेल स्रोत के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सामान्य मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग करके पिछले स्थापित और तीन-चरण ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करते हैं। 3 डी ऑर्गेनॉइड मॉडल ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोग के लिए कई लाभ रखता है। यह सेलुलर संरचना और संगठन के साथ-साथ कण्डरा ऊतकों के सेल-टू-सेल और सेल-टू-मैट्रिक्स इंटरैक्शन की बारीकी से नकल करता है।स्थापित 3 डी कण्डरा-लिगामेंट ऑर्गेनॉइड दृष्टिकोण का उपयोग निम्नलिखित क्षेत्रों में कण्डरा बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए एक मॉडल के रूप में किया जा सकता है। इन विट्रो टेनोजेनेसिस, रोग तंत्र, दवा परीक्षण, और मचान मुक्त कण्डरा ऊतक इंजीनियरिंग में।

demonstration-self-assembled-cell-sheet-culture-manual-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts

Tendons and ligaments (T/L) are strong hierarchically organized structures uniting&#160;the&#160;musculoskeletal system. These tissues have a strictly arranged collagen type&#160;I-rich extracellular matrix (ECM) and T/L-lineage cells mainly positioned in parallel rows. After injury, T/L require a long time for rehabilitation with high failure risk and often unsatisfactory repair outcomes. Despite recent advancements in T/L biology research, one of the remaining challenges is that the T/L field still lacks a standardized differentiation protocol that is able to recapitulate T/L formation process in vitro. For example, bone and fat differentiation of mesenchymal precursor cells require just standard two-dimensional (2D) cell culture and the addition of specific stimulation media. For differentiation to cartilage, three-dimensional (3D) pellet culture and supplementation of TGF&#223; is necessary. However, cell differentiation to tendon needs a very orderly 3D culture model, which ideally should also be subjectable to dynamic mechanical stimulation. We have established a 3-step (expansion, stimulation, and maturation) organoid model to form a 3D rod-like structure out of a self-assembled cell sheet, which delivers a natural microenvironment with its own ECM, autocrine, and paracrine factors. These rod-like organoids have a multi-layered cellular architecture within rich ECM and can be handled quite easily for exposure to static mechanical strain. Here, we demonstrated the 3-step protocol by using commercially available dermal fibroblasts. We could show that this cell type forms robust and ECM-abundant organoids. The described procedure can be further optimized in terms of culture media and optimized toward dynamic axial mechanical stimulation. In the same way, alternative cell sources can be tested for their potential to form T/L organoids and thus undergo T/L differentiation. In sum, the established 3D T/L organoid approach can be used as a model for tendon basic research and even for scaffold-free T/L engineering.

Herein, we demonstrate a three-step organoid model (two-dimensional [2D] expansion, 2D stimulation, three-dimensional [3D] maturation) offering a promising tool for tendon fundamental research and a potential scaffold-free method for tendon tissue engineering.