جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Summary

في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

Abstract

وكانت أول أجنة البويضات cryopreserved بنجاح أكثر من 30 عاما مضت ، عندما يتنغهام

Protocol

أجريت رعاية الحيوان والإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في بحوث الحيوان والإنسان في جامعة برشلونة المستقلة ، إسبانيا.

أولا جمع سيت

1. وحدد الاختيار الهامستر الإناث (Mesocricetus auratus ؛ 12/08 الاسبوع القديمة) من سلالة السوري الذهبي عن وجود إفرازات مهبلية سميكة (التفريغ بعد الإباضي).
2. حمل الإناث المحدد إلى superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 40 وحدة دولية من PMSG (ماري الحامل مصل موجهة الغدد التناسلية) ، يليه 40 وحدة دولية من (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية) قوات حرس السواحل الهايتية 60 ساعة في وقت لاحق.
3. هامستر أنثى الموت ببطء بعد 16 ساعة من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية في غرفة الكربون ثاني أكسيد الكربون.
4. عزل ناقلة البيضات من الإناث كما هو مبين في الفيديو ونقلها إلى قطرة من KSOM - H المتوسط.
5. جمع البويضة ، قزع المجمعات التي تمزق أمبولة قناة البيض تحت المجهر مجسمة في قطرة من هيالورونيداز (156 U / مل) على 37 درجة مئوية. وسيتم اطلاق سراح من خلايا البويضات الركامية في حوالي 5 دقائق.
6. التقاط البويضات من هيالورونيداز وغسلها مرتين في KSOM - H المتوسط.

لجمع أجنة الفئران والفئران الإناث (المصحف العضلة ؛ 6-8 الاسبوع القديمة) وحثهم على superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية من PMSG تليها 5 وحدة دولية من 48 ساعة في وقت لاحق قوات حرس السواحل الهايتية وتزاوج مع الفئران الذكور. وضحى الاناث ، من خلال عنق الرحم في خلع 24-26 ، 44-46 أو 54-56 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية لobtention pronuclear التوالي من 2 خلايا الأجنة أو مرحلة 4 خلايا ، ،. يتم تنفيذ مجموعة من الأجنة pronuclear تماما كما وصفها لالبويضات الهامستر. يتم جمع الأجنة في المراحل 2 - الخلية والخلية 4 * شطف ناقلة البيضات مع KSOM - H المتوسطة [6].
ملاحظة : بعد هذا البروتوكول يمكن جمع حوالي 20 إلى 30 البويضات / الأجنة الإناث من كل.

II. إعداد تجميد والذوبان حلول

1. يعد حل لي تمييع 0.57 مل من propilenglycol في 5 مل من KSOM - H (1.5 م من propilenglycol).
2. يعد حل ذوبان بإضافة 2 مل من KSOM - H إلى أنبوب مع السكروز ز 0.2052 (0.3 م من السكروز).
3. يعد حل تجميد بإضافة 2 مل من محلول الأول لأنبوب مع السكروز ز 0.0684 (1.5 م و 0.1 من propilenglycol السكروز M).

ملاحظة : يجب أن أكون مستعدا الحل والتجميد والذوبان حلول عادلة قبل استخدامها. ومع ذلك ، قد تكون مرجحة لكميات محددة من السكروز لاستخدامها في التحضير للتجميد والذوبان في حلول مسبقة وتخزينها في أنابيب ML - 3 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.

III. تجميد البروتوكول

1. نقل البويضات / الأجنة من المتوسط ​​KSOM - H إلى انخفاض الحل الأول واحتضان ل15/07 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
2. وفي الوقت نفسه ، بإعداد طبق بتري 90 ملم لتحميل القش عن طريق وضع قطرات 90 ميكرولتر من التجمد والذوبان الحلول كما هو مبين في الفيديو (1 قطرة من كل حل / القش).
3. نقل العدد المرغوب فيه من البويضات / الأجنة إلى حل تجميد قطرات.
   ملاحظة : نقوم بنقل عادة ما بين 5-30 البويضات أو الأجنة / قطرة.
4. إرفاق القش لتطلع نظام للرقابة والفم تحميله التالية بهذا الترتيب : الحل الأول ، والهواء ، وانخفاض تجميد البويضات مع والهواء وانخفاض ذوبان الجليد ، والهواء.
5. بمجرد أن يتم تحميل القش ، والحفاظ على الشفط حتى أول انخفاض قدم (الحل الأول) تصل إلى البوليمر في نهاية العلوي من القش والأختام هذه الغاية. الحرارية ختم الطرف الآخر من القش أو الختم مع المكونات البلاستيكية.
6. التبديل في الثلاجة للبرمجة وحدد البرنامج التجمد. ويستند البرنامج تجميد المستخدمة في هذا البروتوكول على معدلات التبريد نشرت أصلا لاسال وآخرون. [7] :
   • 2 درجة مئوية / دقيقة من درجة حرارة الغرفة ل-7 درجة مئوية
     0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 10 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة وتحريض بذر (أنظر أدناه)
   • 0.3 درجة مئوية / دقيقة من -7 -30 درجة مئوية إلى درجة مئوية
     0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 2 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة
   • 35 درجة مئوية / دقيقة من -30 درجة مئوية إلى -130 درجة مئوية
7. تحميل القش على فتحات لصاحب الثلاجة للبرمجة ، والتأكد من أن جزءا من القش مع ذوبان قطرة من حل تواجه الخارج. بدء برنامج التجميد.
8. عندما تصل درجة حرارة العينة -7 درجة مئوية وتبريد قيد الانتظار ، نفذ دليل البذر : ملقط يغرق في النيتروجين السائل ، وسحب أصحاب قليلا من خارج الثلاجة لكشف جزء من القش التي تحتوي على قطرات من ذوبان الحل ، وعلى الفور لمس هذا الجزء من القش مع ملقط. كرر لكل حامل والقش في كل حامل ، واسمحوا ثم تجميد برنامج تشغيل حتى النهاية.
9. عندما يتم الانتهاء من البرنامج ، يغرق في حملة النيتروجين السائل.
10. إزالة من القشأصحاب ونقلها إلى gobelet المسمى.
11. أخيرا ، تخزين gobelet داخل خزان النتروجين السائل.

رابعا. ذوبان بروتوكول

1. إزالة القش من خزان النتروجين السائل.
2. الحفاظ على القش في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 ثانية.
3. نقع القش في حمام الماء عند 30 درجة مئوية خلال 40 ثانية.
4. إزالة المكونات من قش أو خفض رأس الحرارية مختوم.
5. إفراغ القش في طبق بتري 35 ملم والمزيج برفق قطرات يحتويان على تجميد والذوبان الحلول.
6. ترك البويضات / الأجنة في الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. نقل البويضات / الأجنة إلى هبوط جديد للKSOM - H لمدة 15 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية.
8. البويضات / الأجنة على استعداد الآن للتلاعب أخرى.

ملاحظة : أثناء الخطوتين 6 و 7 سترى أن إذابة البويضات / الأجنة تنتفخ ببطء بسبب الجفاف.

خامسا نتائج الممثل

وذكرت واستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد هنا النتائج في معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 95 ٪ للبويضات وحيوانات أليفة 90 ٪> ، 85 ٪ و 80 ٪ للأجنة B6CBAF1 الماوس في pronuclear ، 2 خلية خلية مراحل و 4 على التوالي. عندما يتم تربيتها في المختبر أجنة فئران في KSOM بعد ذوبان الجليد ، وينبغي أن لا يقل عن 70 إلى 80 ٪ تصل إلى مرحلة الكيسة الثقافة في ظروف مثلى.

فمن المستحسن أن تقوم بتضمين مجموعة التحكم (القش) من البويضات / الأجنة في كل تجربة تجميد والذي أذاب هذه المجموعة قبل أن يتم استخدام ما تبقى من البويضات / الأجنة لمزيد من التلاعب. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لمجموعة المراقبة هي أقل مما كان متوقعا ، أذاب آخر القش من الكثير واحد. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لهذه المجموعة الثانية هي أيضا منخفضة ، وتجاهل القش المتبقي من هذا الكثير التجمد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يمكن أن يكون هذا مع البويضات والأجنة الهامستر بروتوكول الماوس cryopreserved بنجاح. المجمدة مرة واحدة ، يمكن تخزين البويضات / الأجنة في النيتروجين السائل الدبابات إلى أجل غير مسمى وتسترد في أي زمان أو مكان المطلوب. هذا يوفر ميزة وجود عينات جاهزة تقريبا لاستخدام كلما دعت الحاجة. من ناحي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R