Сбор и Криоконсервация ооцитов хомяка и мыши Эмбрионы

Резюме

В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.

Аннотация

Эмбрионы и ооцитов были впервые успешно криоконсервированных более 30 лет назад, когда Уиттингем

протокол

Ухода за животными и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, утвержденными Комитетом по этике на человека и животных Исследование Universitat Автономного Барселоны, Испания.

И. ооцитов коллекции

1. Проверить и выбрать женский хомяков (Mesocricetus рыбки; 8-12 недели назад) Золотой сирийской напряжение на наличие толстого выделения из влагалища (постовуляторной разряд).
2. Вызвать выбранных самок superovulate путем внутрибрюшинного введения 40 МЕ PMSG (Беременные Маре Сыворотка гонадотропин), затем 40 МЕ ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) 60 часов спустя.
3. Эвтаназии женщины хомяков 16 часов после введения ХГЧ в камеру углекислого газа.
4. Изолировать от яйцеводы женщины, как показано на видео и передавать их на каплю KSOM-H среды.
5. Сбор ооцит-кучевые комплексов, оторвав яйцевода ампула под стереоскопическим микроскопом в капле гиалуронидазы (156 ед / мл) при 37 ° C. Ооциты будет освобожден от клеток кумулюса примерно в 5 минут.
6. Возьмите ооцитов от гиалуронидазы и мыть их дважды в KSOM-H среды.

Для сбора эмбрионов мыши, самки мышей (Mus мышцы; 6-8 недели назад) индуцируются на superovulate путем внутрибрюшинного введения 5 МЕ PMSG затем 5 МЕ ХГЧ 48 часов спустя, и совокуплялись с самцов мышей. Женщины жертвуют цервикальным сдвигом на 24-26, 44-46 или 54-56 часов после введения ХГЧ для obtention из пронуклеусов, 2-клетки или 4-элементный эмбрионов этапе, соответственно. Сборник пронуклеусов эмбрионов выполняется точно так, как описано для хомяка ооцитов. Эмбрионы на 2-клеток и 4-элементным этапах собираются промывки яйцеводы с KSOM-H среды [6].
Примечание: В соответствии с этим протоколом примерно от 20 до 30 яйцеклеток / эмбрионов могут быть собраны с каждой женщиной.

II. Подготовка замораживания и оттаивания решения

1. Подготовка решение, которое я разбавлением 0,57 мл propilenglycol в 5 мл KSOM-H (1,5 М propilenglycol).
2. Подготовка оттаивания решение, добавив 2 мл KSOM-H для трубы с 0,2052 г сахарозы (0,3 М сахарозы).
3. Подготовка замораживания решение, добавив 2 мл раствора я в трубку с 0,0684 г сахарозы (1,5 М propilenglycol и 0,1 М сахарозы).

Примечание: Я решение и замораживания и оттаивания решения должны быть подготовлены как раз перед их использованием. Тем не менее, указанное количество сахарозы, которые будут использоваться для подготовки замораживания и оттаивания решения могут быть взвешены заранее и хранить в 3 мл трубки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.

III. Замораживание протоколов

1. Передача ооцитов / эмбрионов из KSOM-H средних каплю раствора я и инкубировать в течение 7-15 минут при комнатной температуре.
2. Между тем, подготовить 90 мм чашки Петри для загрузки соломкой, разместив 90 мкл капли замораживания и оттаивания решения, как это показано на видео (1 капля каждого решения / соломы).
3. Передача необходимое количество яйцеклеток / эмбрионов для замораживания капель раствора.
   Примечание: Мы обычно передачи от 5 до 30 яйцеклеток или эмбрионов / вывода.
4. Прикрепить соломенного до устья управляемой системы аспирации и загрузить его следующим таком порядке: решение, которое я, воздуха, замерзания капли с ооцитов, воздух, таяние капли, воздух.
5. После соломы загружена, сохранить аспирационных до первой капли введен (раствор I) достигает полимера на верхнем конце соломы и тюленей в этом направлении. Термо-печать другом конце соломы или печать с пластиковой заглушкой.
6. Включите программируемых морозильник и выберите замораживании программы. Замораживание программы, используемые в настоящем протоколе основан на скоростях охлаждения первоначально опубликовано Лассаля и др.. [7]:
   • 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C
     0 ° С / мин в течение 10 мин, чтобы обеспечить равновесие температуры и индукции посева (см. ниже)
   • 0,3 ° С / мин от -7 ° C до -30 ° С
     0 ° С / мин в течение 2 мин, чтобы обеспечить температуру равновесия
   • 35 ° С / мин от -30 ° С до -130 ° С
7. Нагрузка на соломинки слотов владельца программируемых морозильник, убедившись, что часть соломы с каплей оттаивания решение наружу. Начать замораживание программы.
8. Когда температура образца достигает -7 ° С и охлаждение на удержание, произвести ручную посева: окунуться щипцов в жидкий азот, потяните держатели немного не в морозильник, чтобы выставить часть соломинки содержащие капли оттаивания решение, и сразу же коснуться этой части соломинки с щипцами. Повторите эти действия для каждого держателя, и каждый соломы в держатель, а затем пусть замораживание программы продлится до конца.
9. Когда программа завершится, окунуться держателей в жидком азоте.
10. Удалить из соломкивладельцы и передавать их на помечены gobelet.
11. Наконец, хранить gobelet внутри резервуар жидкого азота.

IV. Размораживание протокола

1. Удалить из соломы резервуар жидкого азота.
2. Поддерживать соломы при комнатной температуре в течение 40 секунд.
3. Замочите соломы на водяной бане при температуре 30 ° С в течение 40 секунд.
4. Удалить вилку из соломы или вырезать термо-запечатанном чаевые.
5. Пустые соломы в 35-мм чашки Петри и хорошо смешайте две капли, содержащие замораживания и оттаивания решений.
6. Оставьте ооцитов / эмбрионов в смеси в течение 15 минут при комнатной температуре.
7. Передача ооцитов / эмбрионов свежие капли KSOM-H для еще 15 минут при 37 ° C.
8. Ооцитов / эмбрионов теперь готовы для дальнейшей манипуляции.

Примечание: Во время действия 6 и 7 вы увидите, что талые яйцеклеток / эмбрионов медленно раздуваются за счет регидратации.

Результаты В. представитель

Использование протокола криоконсервации сообщили здесь результаты в выживаемости примерно 95% для хомяка ооцитов и> 90%, 85% и 80% для мыши B6CBAF1 эмбрионов на пронуклеусов, 2-клеток и 4-элементным этапах соответственно. Когда мышь эмбрионы культивировали в пробирке в KSOM после оттаивания, по крайней мере от 70 до 80% должна достичь стадии бластоцисты в оптимальных условиях культуры.

Рекомендуется, чтобы вы включили контрольной группе (соломы) ооцитов / эмбрионов в каждом замораживания эксперимент, и что вы оттепель эту группу раньше остальных яйцеклеток / эмбрионов используются для дальнейших манипуляций. Если выживаемость в контрольной группе ниже, чем ожидалось, оттепель другой соломы от той же партии. Если выживаемость для этой второй группы также низко, отбросить оставшиеся соломинки из этого замораживания много.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

С помощью этого протокола хомяка ооцитов и эмбрионов мыши могут быть успешно криоконсервированных. Как только замороженные, ооциты / эмбрионы могут храниться в жидком азоте танки на неопределенный срок и восстановления в любое время или место лучшего. Это дает преимущество, что образцы почти гот?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R