Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d'embryons de souris

Résumé

Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

Résumé

Les embryons et ovocytes ont d'abord été cryoconservés avec succès plus de 30 ans, quand Whittingham

Protocole

Les soins des animaux et des procédures ont été menées selon les directives et règlements approuvés par le Comité d'éthique sur la recherche animale et humaine de l'Universitat Autònoma de Barcelone, en Espagne.

Recueil ovocytaire I.

1. Vérifier et sélectionner les hamsters femelles (Mesocricetus auratus; 8-12 semaines est vieux) de la souche d'or syrien pour la présence d'un écoulement épais vaginale (décharge postovulatoire).
2. Induire les femmes sélectionnées pour superovulate par injection intrapéritonéale de 40 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) suivi par 40 UI de hCG (gonadotrophine chorionique humaine) 60 heures plus tard.
3. Euthanasier les hamsters femelles 16 heures après l'administration de hCG dans une chambre de dioxyde de carbone.
4. Isoler oviductes des femelles, comme indiqué dans la vidéo et les transférer à une baisse de KSOM-H moyenne.
5. Recueillir ovocyte-cumulus complexes en déchirant l'ampoule tubaire sous un microscope stéréoscopique dans une goutte d'hyaluronidase (156 U / ml) à 37 ° C. Les ovocytes seront libérés par les cellules du cumulus en environ 5 minutes.
6. Pick up à partir d'ovocytes hyaluronidase et les laver deux fois dans KSOM-H moyenne.

Pour la collecte d'embryons de souris, les souris femelles (Mus musculus; 6-8 semaines est vieux) sont amenés à superovulate par injection intrapéritonéale de 5 UI de PMSG suivie par 5 UI de hCG 48 heures plus tard et accouplées avec des souris mâles. Les femelles sont sacrifiées par dislocation cervicale p. 24-26, 44-46 ou 54-56 heures après l'administration d'hCG pour l'obtention du pronucléaire, 2-cellules ou embryons au stade 4 cellules, respectivement. Collecte des embryons pronucléaire est réalisée exactement comme décrit pour les ovocytes de hamster. Les embryons au stade 2-cellules et 4-cellules sont collectées par rinçage des oviductes avec KSOM-H moyenne [6].
Note: Suite à ce protocole environ 20 à 30 ovocytes / embryons peuvent être recueillies auprès de chaque femme.

II. Préparation du gel et de dégel des solutions

1. Préparer la solution en diluant I 0,57 ml de propilenglycol dans 5 ml de KSOM-H (1,5 M de propilenglycol).
2. Préparer la solution de décongélation en ajoutant 2 ml de KSOM-H à un tube avec 0,2052 g de saccharose (0,3 M de saccharose).
3. Préparer la solution de gel en ajoutant 2 ml de solution de I à un tube avec 0,0684 g de saccharose (1,5 M de propilenglycol et 0,1 M de saccharose).

Note: Je Solution et gel et de dégel des solutions doivent être préparées juste avant leur utilisation. Toutefois, les montants spécifiés de saccharose à être utilisé pour la préparation du gel et de dégel des solutions peuvent être pondérées à l'avance et stockées dans 3 ml de tubes à température ambiante pendant plusieurs mois.

III. Protocole de congélation

1. Ovocytes Transfert / embryons à partir du milieu KSOM-H à une goutte de solution de I et incuber pendant 7-15 minutes à température ambiante.
2. Pendant ce temps, préparer une boîte de Petri de 90 mm pour charger les pailles en plaçant 90 gouttes ul du gel et de dégel des solutions comme il est montré dans la vidéo (1 goutte de chaque solution / paille).
3. Transférer le nombre souhaité d'ovocytes / embryons aux gouttes solution de congélation.
   Note: Nous transfèrent habituellement entre 5 à 30 ovocytes ou d'embryons / déposer.
4. Attacher une paille pour un système d'aspiration contrôlée bouche et le charger suivant cet ordre: la solution, je, l'air, chute de la congélation des ovocytes avec, l'air, chute de dégel, de l'air.
5. Une fois que la paille est chargé, continuez jusqu'à la chute de l'aspiration première fois (solution I) atteint le polymère à l'extrémité supérieure de la paille et les joints à cette fin. Thermo-joint l'autre bout de la paille ou les sceller avec un bouchon en plastique.
6. Mettez le congélateur programmable et sélectionnez le programme de congélation. Le programme de congélation utilisé dans ce protocole est basé sur le taux de refroidissement initialement publié par Lassalle et al. [7]:
   • 2 ° C / min de la température ambiante à -7 ° C
     0 ° C / min pendant 10 min pour permettre l'équilibrage de température et de l'induction de l'ensemencement (voir ci-dessous)
   • 0,3 ° C / min de -7 ° C à -30 ° C
     0 ° C / min pendant 2 min pour permettre l'équilibrage de température
   • 35 ° C / min de -30 ° C à -130 ° C
7. Chargez les pailles sur les fentes de la porte du congélateur programmable, en s'assurant que la partie de la paille avec la goutte de solution de décongélation est orientée vers l'extérieur. Démarrez le programme de congélation.
8. Lorsque la température de l'échantillon atteint -7 ° C et le refroidissement est en attente, effectuer le semis manuel: plonger la pince dans l'azote liquide, tirez sur la porte un peu hors du congélateur pour exposer la partie de la paille contenant les gouttes de solution de dégel, et immédiatement toucher cette partie de la paille avec la pince. Répétez l'opération pour chaque titulaire et chaque paillette dans le support, puis laisser le programme de congélation jusqu'à la fin.
9. Lorsque le programme est terminé, plongent les porteurs dans l'azote liquide.
10. Retirer les pailles de lales titulaires et les transférer à un gobelet étiqueté.
11. Enfin, rangez le gobelet intérieur d'un réservoir d'azote liquide.

IV. Le dégel du protocole

1. Retirer la paille du réservoir d'azote liquide.
2. Maintenir la paille à température ambiante pendant 40 secondes.
3. Faire tremper la paille dans un bain-marie à 30 ° C pendant 40 secondes.
4. Enlevez le bouchon de la paille ou couper le bout thermo-scellés.
5. Videz la paille dans un plat de 35 mm de Pétri et mélanger délicatement les deux gouttes contenant le gel et le dégel des solutions.
6. Laisser ovocytes / embryons dans le mélange pendant 15 minutes à température ambiante.
7. Transfert des ovocytes / embryons à une baisse des frais KSOM-H pour 15 minutes supplémentaires à 37 ° C.
8. Ovocytes / embryons sont maintenant prêts pour d'autres manipulations.

Remarque: Pendant les étapes 6 et 7 vous devriez voir que les ovocytes décongelés / embryons lentement gonfler à cause de la réhydratation.

Résultats Représentant V.

L'utilisation du protocole de cryoconservation rapportés ici en résulte un taux de survie d'environ 95% des ovocytes de hamster et de> 90%, 85% et 80% pour la souris B6CBAF1 embryons au pronucléaire, 2 cellules-étapes et 4 cellules, respectivement. Lorsque des embryons de souris sont cultivées in vitro dans KSOM après décongélation, au moins 70 à 80% devrait atteindre le stade de blastocyste dans des conditions optimales de culture.

Il est recommandé d'inclure un groupe témoin (paille) des ovocytes / embryons dans chaque expérience de congélation et de dégel que vous ce groupe avant que le reste des ovocytes / embryons sont utilisés pour des manipulations supplémentaires. Si les taux de survie pour le groupe contrôle sont plus faibles que prévu, décongeler une autre de paille provenant du même lot. Si les taux de survie pour ce second groupe sont également faibles, jeter le reste des pailles provenant de ce lot de gel.

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Discussion

Avec ce protocole d'ovocytes de hamster et d'embryons de souris peuvent être cryoconservés avec succès. Une fois congelés, les ovocytes / embryons peuvent être conservés dans des cuves d'azote liquide indéfiniment et récupérer à tout moment ou le lieu désiré. Ceci offre l'avantage d'avoir des échantillons de presque prêt à utiliser dès que nécessaire. D'autre part, ce protocole peut également être utilisé pour générer cryobanques embryon à partir de souches de souris précieuses (telles que des...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R