Hamster Oosit ve Fare Embriyolar Toplama ve Kriyoprezervasyon

Özet

Bu video-makale-çözülme sonrası sağkalım oranları yüksek bir hamster oosit toplamak ve cryopreserve nasıl bir adım-adım gösteri sunuyoruz. Aynı işlem, başarılı bir şekilde dondurma ve preimplantasyon gelişimi farklı aşamalarında fare embriyoları Çözülme uygulanabilir.

Özet

Zaman Whittingham Embriyolar ve oositlerin ilk başarıyla, 30 yıldan daha uzun önce Kriyoprezerve edildi

Protokol

Hayvan bakım ve prosedürleri, Barselona, ​​İspanya Universitat Autonoma Hayvan ve İnsan Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmış kurallar ve düzenlemelere göre yapılmıştır.

I. Oosit toplama

1. Altın Suriye suşu kalın bir vajinal akıntı (postovulatory akıntı) varlığı için; dişi hamster (8-12 hafta eski Mesocricetus auratus) kontrol edin ve seçin.
2. 60 saat sonra intraperitoneal (Gebe Kısrak Serum gonadotropin) hCG (insan koryonik gonadotropin) 40 IU 40 IU PMSG superovulate için seçilen kadın neden.
3. Karbon dioksit odası hCG uygulanmasından 16 saat sonra dişi hamster Euthanize.
4. Siyon hatası videoda gösterildiği gibi kadın izole etmek ve KSOM-H orta bir damla aktarabilirsiniz.
5. 37 hiyalüronidaz (156 U / ml), bir damla stereoskopik mikroskop altında yumurtalık ampulla yırtarak oosit-kümülüs kompleksleri toplayın ° C. Oosit kümülüs hücreleri yaklaşık 5 dakika içinde serbest olacak.
6. Hiyalüronidaz gelen oosit pick up ve KSOM-H orta ve iki kez yıkayın.

Fare embriyo toplanması için, dişi farelerde (Mus musculus; 6-8 hafta eski) daha sonra 5 IU hCG 48 saat takip ve erkek fareler ile evlendirilen PMSG 5 IU intraperitoneal superovulate indüklenen. Dişiler 24-26 servikal dislokasyon ile sakrifiye pronükleer, 2-hücre veya 4-hücreli aşamada embriyoların sırasıyla obtention hCG uygulandıktan sonra 44-46 veya 54-56 saat. Pronükleer embriyoların toplanması tam bir hamster oosit açıklandığı gibi yapılır. 2-hücre ve 4-hücreli aşamada Embriyolar KSOM-H orta [6] siyon hatası kızarma toplanır.
Not: Bu protokol sonrasında yaklaşık olarak 20 ila 30 oosit / embriyoların her kadın alınacak .

II. Dondurma ve çözme çözümler hazırlanması

1. Propilenglycol KSOM-H (propilenglycol 1.5 M) 5 ml, 0.57 ml seyreltilmesiyle çözüm hazırlayın.
2. 0,2052 g sakkaroz (sakkaroz 0.3 M) ile bir tüp KSOM-H 2 ml ekleyerek çözülme çözüm hazırlayın.
3. 0,0684 g sakaroz (1.5 propilenglycol M ve 0.1 M sakkaroz) ile bir tüp çözümü ben 2 ml ekleyerek donma çözüm hazırlayın.

Not: Çözüm I ve çözümler dondurma ve çözme sadece kendi kullanmadan önce hazır olmalıdır. Ancak, donma ve çözülme çözümler hazırlanması için kullanılacak sakaroz belirtilen miktarlarda avans ağırlıklı ve birkaç ay için 3 ml tüpler oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

III. Donma protokol

1. Transfer oosit / KSOM-H orta çözümü ben bir damla ve 7-15 dakika oda sıcaklığında inkübe embriyolar.
2. Bu arada, 90 video (1 damla her çözüm / saman) görüldüğü gibi, dondurma ve çözme çözümler ul damla koyarak payet yüklemek için 90 mm petri hazırlar.
3. İstenilen sayıda oosit / embriyo dondurma çözüm damla aktarın.
   Not: Biz genellikle 5 ila 30 oosit veya embriyo / bırak arasında transfer.
4. Ağız kontrollü aspirasyon sistemi bir saman takın ve bu sırada aşağıdaki yükü: çözümü, hava, oosit, hava, çözülme damla, hava ile dondurma bırak.
5. Saman yüklendikten sonra, saman ve mühürler Bu amaçla en sonunda polimer ulaşan ilk damla (çözüm) tanıtıldı kadar aspire tutun. Termo-plastik bir fiş ile saman veya mühür mühür diğer ucunu.
6. Programlanabilir dondurucu açın ve donma programı seçin. Bu protokolde kullanılan dondurma programı, Lassalle ve arkadaşları tarafından yayınlanan soğutma hızları dayanır. [7]:
   • -7 Oda sıcaklığında 2 ° C / dak ° C
     0 ° C / dk 10 dk tohum sıcaklık dengeleme ve indüksiyon için izin (aşağıya bakın)
   • -7 'Den 0,3 ° C / dak ° C ila -30 ° C
     0 ° C / dk 2 dk sıcaklık dengelenmesi için izin
   • 35 ° C / dak -30 ° C -130 ° C
7. Çözülme çözüm damla ile saman parçası dışa karşı karşıya olduğunu emin olun, programlanabilir dondurucu sahibinin yuvaları payet yükleyin. Donma programını başlatın.
8. Örnek sıcaklığı -7 ° C ve soğutma beklemeye ulaştığında, elle tohumlama gerçekleştirin: sıvı azot içine atılmak forseps, hemen çözüm çözülme damla içeren payet bölümünü ortaya çıkarmak için, hafifçe dışarı dondurucu sahiplerine doğru çekin ve forseps ile payet bu dokunun. Sahibinin her tutucu ve her saman için tekrarlayın ve sonra donma program sonuna kadar işletilen sağlar.
9. Program tamamlandığında, sıvı nitrojen içinde sahiplerine dalıyoruz.
10. Payet Kaldıretiketli gobelet sahipleri ve aktarabilirsiniz.
11. Son olarak, bir sıvı nitrojen tankı içinde gobelet saklayın.

IV. Protokol Çözülme

1. Sıvı nitrojen tankı saman çıkarın.
2. 40 saniye boyunca oda sıcaklığında saman koruyun.
3. 40 saniye boyunca 30 ° C'de su banyosunda saman bekletin.
4. Saman fişi çıkarın veya termo-mühürlü ucu kesmek.
5. 35 mm petri saman boşaltın ve hafifçe donma ve çözülme çözümler içeren iki damla karıştırın.
6. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karışımı oosit / embriyoların bırakın.
7. 37 KSOM-H taze bir damla ilave bir 15 dakika için oosit / embriyo transferine ° C
8. Oosit / embriyoların şimdi manipülasyon için hazır.

Not: 6. ve 7. adımları sırasında çözülmüş oosit / embriyoların yavaş rehidrasyon için nedeniyle şişer göreceksiniz.

V. Temsilcisi Sonuçlar

Kriyoprezervasyon protokol burada bir hamster oosit için yaklaşık% 95 ve>% 90,% 85 ve fare B6CBAF1 embriyolar pronükleer, 2-hücre ve 4-hücreli aşamaları sırasıyla% 80, sağ kalım oranı sonuçlar bildirdi. Fare embriyoları çözme sonrası KSOM in vitro kültür, en az 70 ila% 80, en iyi kültür koşullarında blastosist aşamasına ulaşması gerekir.

(Saman) ve oosit / embriyo dondurma her deneyde bir kontrol grubu yer almasını tavsiye ederiz oosit / embriyo geri kalanında daha fazla manipülasyonları için kullanılan önce bu grup Çözülme. Kontrol grubunda sağkalım oranları beklenenden daha düşük ise, aynı partinin diğerine saman Çözülme. Bu ikinci grup için sağkalım oranları da düşük ise, bu dondurma çok kalan payet atın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, bir hamster oosit ve fare embriyoları ile başarıyla Kriyoprezerve olabilir. Bir kez dondurulmuş, oosit / embriyoların sıvı nitrojen tanklarında süresiz saklanır ve istenilen herhangi bir yerde veya zamanda telafi edilebilir. Bu ihtiyaç duyulduğunda kullanmak örneklerin neredeyse hazır sahip olmanın avantajını sunar. Öte yandan, bu protokol de, canlı hayvan kolonileri bakımı, ekonomik ve güvenli bir alternatif olarak değerli fare suşları (transgenik hatları gibi), embriyo cryobanks oluşturmak için kul...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
French type mini-straw 0.25 ml		Mini-tub	13407/0010
hCG		Farma-Lepori, Spain	749036.4
Hyaluronidase		Sigma	H-3884
KSOM-H medium				Ref. [11]
Liquid Nitrogen		Air Liquide
Plastic plugs		Mini-tub	19046
PMSG		Intervet, Spain	1.614/8447
Propilenglycol		Fluka	82280
Sucrose		Merck	107687
Surgical Scissors		Aesculap	BC-060R; BG-061R
Thermo-sealer		SIZ	220
35 and 90 mm culture dishes		Nunc	153066; 150350
10 ml tubes		Greiner Bio-one	163160
Nitrogen tank		MVE, Cryogenics	XC 43/28
Programmable Freezer		Planner Products Ltd.	Kryo-10 Series III
Forceps		Aesculap	BD-331R; BD-053R; OC-020R