Method Article
هذا الإجراء يوضح كيفية استخدام الجينات electroporation MXcell بولسير النظام بسرعة وبسهولة تحديد أفضل الظروف لelectroporation الليفية الماوس الجنينية (MEFs) أو الخلايا الأولية الأخرى. وتناقش أيضا اعتبارات المشاكل المرتبطة في شريط الفيديو.
أصبح من الواضح بشكل متزايد أن electroporation هي الطريقة الأكثر فعالية لإدخال الحمض النووي البلازميد أو سيرنا داخل الخلايا الأولية. وضعت خصيصا لجين electroporation MXcell بولسير النظام والعازلة جين electroporation بولسير (بيو راد) لtransfect بسهولة الأحماض النووية في خلايا الثدييات والتي يصعب transfect الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية الأولية و. سوف نقوم شرح كيفية إجراء تجربة بسيطة لتحديد أفضل الظروف بسرعة electroporation. سوف نقوم شرح كيفية تشغيل عدة عينات من خلال مجموعة من الشروط electroporation بحيث يمكن إجراء تجربة في نفس الوقت الذي يتم تنفيذ التحسين. وسوف نعرض أيضا كيفية تحديد الظروف المثلى باستخدام 96 - جيدا لوحات electroporation يمكن استخدامها مع cuvettes electroporation القياسية ، وتسهيل الانتقال من لوحات لelectroporation cuvettes electroporation مع الحفاظ على كفاءة electroporation نفسه. في الفيديو ، وسوف نناقش أيضا بعض العوامل الرئيسية التي يمكن أن تؤدي إلى نجاح أو فشل التجارب electroporation.
1) إعداد خلية
2) إعداد السفينة وElectroporation electroporation
الإعداد لوحة وelectroporation
كفيت والإعداد electroporation
نتائج الممثل 3)
بعد transfecting الخلايا ويسمح لهم باسترداد ، وتحليل كفاءة ترنسفكأيشن نوعيا ، وذلك باستخدام المجهر epifluorescent ، والكمية ، وذلك باستخدام التدفق الخلوي.
الشكل 1. الخلايا التي تم electroporated بنجاح والآن يعبرون عن الجين GFP تظهر تحت المجهر epifluorescent.
الشكل 2. الشخصية الخلايا تحت النقيض من مرحلة التصور يسمح للخلايا كلا transfected وuntransfected. هذه هي الخلايا التي تعرضت لنبض أدنى جهد في electroporation 200V. كانت الخلايا متموجة إلى حد كبير نظرا للكثافة العالية الخلية.
الشكل 3. الحقل نفسه تحت نظر epifluorescence يظهر عددا من الخلايا يعبرون عن علامة GFP ، ولكن هذه ليست سوى نسبة صغيرة من الخلايا مرئية في الصورة السابقة.
الشكل 4. وفي 250V ، فإن العدد الكلي للخلايا حية تحت المقابل شهدت انخفاضات طفيفة المرحلة.
الشكل 5. epifluorescence كيل ، يمكن للمرء أن يرى أن عددا من الخلايا معربا عن GFP قد ازداد.
الشكل 6. وفي أعلى الجهد تطبيقها ، 375V ، هناك عدد أقل من خلايا حية مرئية.
الشكل 7 ، ولكن نسبة كبيرة من الخلايا المتبقية يعبرون عن GFP. الشرط الأمثل الذي يعتمد على التصميم التجريبي. في بعض التجارب قد لأكبر عدد من الخلايا transfected يكون الأمثل ، في التجارب الأخرى ترنسفكأيشن أعلى نسبة قد تكون أفضل.
ونحن مهتمون في نسبة الخلايا التي يتم GFP إيجابية تحت كل حالة ، وكيف تختلف النسب المئوية مع التقدم في العمر الخلية. التدفق الخلوي يمكن توفير معلومات كمية عن نتائج ترنسفكأيشن تحت كل الظروف electroporation مختلفة.
الشكل 8 ، وهنا نسبة الخلايا التي يتم GFP الإيجابية في مرور 5 يتم عرض الخلايا تحت كل الظروف electroporation 12. النسبة القصوى ترنسفكأيشن كان ما يقرب من 80 ٪ تحت نبض الجهد تسوس أعلى الأسي ، حالة 6 ، و 70 ٪ في ظل موجة النبض أقوى اختبار مربع ، حالة 12.
الرقم 9. ومع مرور الخلايا 9 مرات قبل electroporation ، والنمط العام لنسبة ترنسفكأيشن غير متطابقة تقريبا ، ولكن مع انخفاض طفيف جدا في نسبة ترنسفكأيشن.
الرقم 10. المعروضة هنا هي النسب المئوية للخلايا في GFP مرور 13 الخلايا التي تظهر انخفاضا ملحوظا في نسبة ترنسفكأيشن نسبة إلى أصغر الخلايا. وكانت أعلى النسب المئوية ترنسفكأيشن ما يقرب من نصف ما تم تحقيقه مع الخلايا الأصغر سنا مما يدل على أهمية استخدام الخلايا السليمة في أقرب وقت ممكن بعد العزلة.
شروط Electroporation المستخدمة لخلايا MEF transfecting باستخدام الجينات بولسير MXcell | ||
الشرط (1-6) البقول تسوس الأسي ، مع كل 350 UF ، 1000ohm | الجهد (V) | |
1 | 200 | |
2 | 250 | |
3 | 300 | |
4 | 326 | |
5 | 350 | |
6 | 376 | |
الشرط (7-12) البقول مربع الموج ، مع كل UF 2000 ، أوم 1000 ، ونبض 1 | الجهد (V) | نبض المدة (مللي ثانية) |
7 | 200 | 10 |
8 | 250 | 10 |
9 | 300 | 10 |
10 | 200 | 20 |
11 | 250 | 20 |
12 | 300 | 20 |
هذه المقالة فيديو يوضح كيفية استخدام نظام electroporation MXcell من التعرف بسهولة electroporation الظروف المثلى لMEFs أو غيرها من خطوط الخلايا الأولية. شكل لوحة 96 - جيدا يسمح لكثير من الظروف التجريبية متماثلة أو التحسين التي سيتم تنفيذها في وقت واحد ، والتي يمكن للقضاء على الحاجة لاجراء تجارب عديدة منفصلة. في حين أن تنفيذ هذا الإجراء ، ينبغي للمرء أن نتذكر أن استخدام الخلايا السليمة في أقرب وقت ممكن بعد عزل واستخدام electroporation الظروف التي تتناسب مع المنطقة العازلة electroporation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gene Pulser® Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2676 | |
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2673 | |
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2674 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved